锌掺杂二氧化硅在雪菊中木犀草苷分析中的应用*

韩 想， 阿迪拉·阿布都热西提， 贺小刚，冯昱龙， 楚刚辉

(新疆药食用植物资源化学重点实验室 喀什大学 化学与环境科学学院，新疆 喀什 844000)

0 引 言

植物材料中的生物活性成分是新药、功能性食品和食品添加剂的重要来源，这些活性成分主要是通过溶剂萃取从植物中得到的，这些活性成分具有多种结构的化合物组成，如萜类，醌类，黄酮类和生物碱类化合物。在各种生物活性成分分离方法中吸附分离法因为其具有高效，经济的特点，在研究领域中得到了普遍认可和应用[1-2]。木犀草苷是雪菊中的黄酮类活性成分之一，对雪菊的分析主要体现在对黄酮类物质的提取及含量检测方法研究，对分离提纯等方面的研究相对较少[3-8]。木犀草苷是一种黄酮糖苷类化合物，即由木 犀草素结合一个单糖获得的产物，研究表明，木犀草苷具有一系列药理活性，如降低胆固醇含量，呼吸道杀菌作用以及抗肿瘤，抗感染，抗炎等作用，目前植物样品中木犀草苷测定的方法较多的是色谱法及色谱联用法，但这些方法却在不同程度上存在着仪器成本较高，操作起来繁琐，有机溶剂消耗量大等缺陷[9-14]。

由于检测快速、易实现在线监测、对样品无损害等特点，近红外光谱分析被许多行业如烟草生产、农业应用和制药分析等领域中大量使用[15-17]。为了进一步改善近红外光谱分析方法的灵敏度，前人在将吸附预富集技术与近红外光谱技术相结合测定微量成分的研究中取得了许多研究成果[18-20]。研究发现，木犀草素在一定条件下可以和某些金属离子发生配位作用[21-23]，木犀草苷作为木犀草素的衍生物，基于这些研究，也可以考虑通过配位作用实现木犀草苷的分离富集。本研究通过制备的锌掺杂二氧化硅作为吸附剂对雪菊所含的微量木犀草苷进行富集，采用近红外漫反射结合化学计量学实现其中木犀草苷的灵敏、选择性检测。

1 实验部分

1.1 仪器和材料

AntarisⅡ近红外光谱仪(美国Thermo 公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；HY-2 型多用调速振荡器(苏省金坛医疗仪器厂)；TU-1900 型双光束紫外可见分光光度计( 北京普析通用仪器有限公司)；SF-TDL-2SOA低速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)；IR-200型红外光谱仪(美国Thermo公司)；WS70-1红外快速干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)。

木犀草苷(上海晶纯生化科技股份有限公司，98%)；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，98%)；无水乙醇、正硅酸乙酯、氢氧化钠、甲醇、乙酸锌等均为分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 锌掺杂二氧化硅吸附材料的制备

称量4.39 g乙酸锌固体，加入甲醇试剂充分溶解，转移到100 mL容量瓶中，定容，静置备用。在250 mL的三颈烧瓶加入50 mL无水乙醇、2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、10 mL正硅酸乙酯和50 mL 0.2 mol·L-1的乙酸锌甲醇溶液，35 ℃水浴下搅拌1 h，之后添加10 mL 1% 氢氧化钠溶液充分搅拌12 h；可能的合成机理见图1。

最后利用低速离心机离心分离，收集最终产物，蒸馏水洗调节pH至7左右，最后无水乙醇再洗涤一次，离心，并将产物于60 ℃烘干待用。

图1 锌掺杂二氧化硅吸附剂合成机理Fig 1 Synthesis mechanism of zinc-doped silica adsorbent

1.2.2 木犀草苷的吸附试验

把木犀草苷作为分析测试对象，称量0.25 g吸附剂(锌掺杂二氧化硅材料)于100 mL的锥形瓶中，加入50.00 mL 配制好的木犀草苷样品溶液，在常温下于振荡器中振荡20 min，使用量筒式过滤器，收集滤渣进行近红外光谱分析；在349 nm处测量滤液的吸光度，计算木犀草苷的吸附率，公式如下：

上式中，B0和B表示木犀草苷溶液吸附前和吸附后的吸光值。

1.2.3 木犀草苷样品的制备与富集

木犀草苷样品存在于雪菊提取液中，雪菊提取液的制备如下：量取适量雪菊，浸泡在含50 mL 35%的甲醇水溶液的100 mL锥形瓶中，放置过夜，将雪菊样品超声30 min，并过滤，收集备用，将上述溶液制备成不同浓度的69个雪菊提取液，浓度范围为0.05～15.0 mg·L-1。称量0.25 g锌掺杂二氧化硅吸附剂于100 mL锥形瓶中，将上述制备的69个雪菊提取液分别倒入放置了吸附剂的锥形瓶中，并将这69个锥形瓶分别于常温下振荡20 min，抽滤，滤渣晾干(室温)，使用近红外光谱直接检测富集了木犀草苷的锌掺杂二氧化硅吸附剂。将得到的69个固体样本近红外光谱，其中有47个定量校正模型，22 个预测样本(9对重复样本)，建立了近红外光谱分析方法。

1.2.4 光谱测量方法

在波数为4 000～10 000 cm-1之间进行扫描，4 cm-1的仪器分辨率，经积分球漫反射模式采集所有样品的近红外光谱，光谱仪于室温下预热1 h后开始进行测量，每隔1 h对其进行校正。每个样品光谱及背景光谱均要经过64次扫描，并进行3次重复装样后测量，以提高仪器的信噪比，降低误差。3次测量的光谱数据取平均值，以考虑样品内部的变异性以及堆积密度和粒径的差异。图2为69个样品的近红外光谱，为了揭示近红外光谱数据中存在的信息，必须通过一个校准的过程来建立预测模型。校准阶段使用的样本数据集必须代表当前和未来的预测样本。这意味着在校准和验证样本数据集中必须考虑所有预期的变异源。在这里我们使用了偏最小二乘回归(PLSR)来构建校正模型。并使用TQ analyst 9仪器软件包选择了4 188.6～9 009.8 cm-1的波长范围。

图2 69个雪菊样本的近红外光谱Fig 2 Near-infrared diffuse reflectance spectra of the 69 luteoloside samples

2 结果与讨论

2.1 锌掺杂二氧化硅吸附剂的红外光谱

分别将二氧化硅与锌掺杂二氧化硅吸附剂和KBr按1:100～200压片，扫描300～4 000 cm-1范围内红外光谱，结果见图3。通过与二氧化硅吸附剂的红外光谱(a曲线)相比较，锌掺杂二氧化硅吸附剂的红外光谱(b曲线)在3 400～3 200 cm-1范围内出现了氨基伸缩振动峰，在3 000～2 700 cm-1出现了饱和C-H伸缩振动峰，在1 600 cm-1左右处出现了碳碳双键伸缩振动峰，在1 375 cm-1左右出现了甲基的C-H对称弯曲振动峰，在720 cm-1左右出现了—(CH2)n—的面内摇摆振动峰。与二氧化硅的红外光谱相比，锌掺杂二氧化硅吸附剂中这些新峰的出现说明了金属离子锌已经结合到SiO2上。吸附木犀草苷后的锌掺杂二氧化硅吸附剂的红外光谱(c曲线)在3 400～3 200 cm-1范围内出现了氨基伸缩振动峰，在1 650～1 560 cm-1范围内出现氨基的弯曲振动峰，但这两个峰明显比b曲线吸收减弱，说明木犀草苷吸附到了锌掺杂二氧化硅吸附材料上。

图3 二氧化硅(a)，锌掺杂二氧化硅吸附材料(b)和吸附木犀草苷后锌掺杂二氧化硅吸附材料(c)的红外光谱Fig 3 Infrared spectrogram of silicon and zinc-doped silica adsorption materials before and after adsorption of luteoloside

2.2 锌掺杂二氧化硅对木犀草苷的吸附

为考察所制备的锌掺杂二氧化硅吸附剂对木犀草苷的吸附情况，分别对木犀草苷水溶液和吸附抽滤后的滤液检测紫外光谱，并将两者的紫外光谱绘图做对比，如下图4。

由图可知：在波长为349 nm下，木犀草苷出现了特征吸收，对比木犀草苷标准溶液(10 mg·L-1)的吸收曲线(a)，被锌掺杂二氧化硅吸附材料吸附后的吸收曲线(b)显示，在349 nm处的吸光度明显减少。根据吸附材料上的官能团推测，它对木犀草苷的吸附机理可能是由于锌与木犀草苷上的羟基络合所致[24-26]，可能的机理见图5，由图5可以看出，锌掺杂二氧化硅的吸附材料对木犀草苷的吸附效果比较好。

图4 木犀草苷标准溶液吸附前(a)及吸附后(b)的紫外光谱Fig 4 UV spectra change for luteoloside before and after the adsorption

图5 木犀草苷的吸附机理Fig 5 Adsorption mechanism of luteoloside

2.3 影响锌掺杂吸附剂吸附木犀草苷过程的因素

2.3.1 质量对吸附能力的影响

准确配制10 mg·L-1木犀草苷的水溶液，用电子天平准确称得0.15、0.20、0.25、0.30 g的吸附材料，分别加入100 mL锥形瓶中再向瓶中加入50.00 mL木犀草苷水溶液，充分振荡20 min后进行抽滤并取其清液，于波长为349 nm下分别测定它们的吸光度，根据1.2.2的方法计算吸附率，并以吸附率对吸附材料用量(质量)作图，其结果如下图6(a)。由图可以看出，木犀草苷的吸附率随着吸附材料的质量增加而增加，当吸附材料的质量是0.25 g时吸附率为最大即87.1%，之后吸附率几乎不再变化，故吸附材料的最恰当使用质量为0.25 g。

2.3.2 pH对吸附能力的影响

另外，对pH的影响进行讨论，准确配制pH为2、4、6、7、8、10的浓度均为10 mg·L-1的木犀草苷溶液。称量0.25 g的锌掺杂二氧化硅吸附剂，按照1.2.2的方法振荡吸附，于波长为349 nm下测定吸附后的吸光度，计算吸附率，并用吸附率对pH作图，见下图6(b)。由图可知：木犀草苷的吸附率随着pH值的增大而增大，在pH大于或等于7时，木犀草苷的吸附率基本不再发生变化，基本趋于稳定状态，因此选择pH为7的中性条件下进行吸附，且此时木犀草苷的吸附率为86.7%。

2.3.3 时间对吸附能力的影响

配制10 mg· L-1木犀草苷的水溶液，称量0.25 g锌掺杂二氧化硅吸附剂，在室温下振荡2、5、10、20、30、40、60 min，离心后取上层清液，在波长为349 nm下测定它们的吸光度并计算其吸附率，以吸附率对吸附时间作图，见下图6(c)。由图可知，振荡时间在20 min时木犀草苷的吸附率到达最大值，在此时间下吸附率达到了87.1%，因此20 min为最佳振荡时间。

图6 质量(a)、pH(b) 及时间(c)对吸附的影响Fig 6 Effects of quality, pH and time on the adsorption

2.4 用近红外光谱定量分析木犀草苷的结果

2.4.1 建立木犀草苷定量校正模型

根据PLS建立了木犀草苷定量模型，为了完善定量校正模型，采用多元散射校正(MSC) 、一阶导数(1st ) 、Savitzky-Golay(SG) 平滑、 小波变换(CWT) 、标准正态变换(SNV)对光谱的数据进行了预处理[27-28]。根据蒙特卡洛交叉验证(MCCV) 法得到模型的因子数为6、7、8，不同的光谱预处理方法得到的木犀草苷PLS 定量校正模型的结果见表1 。这是由于近红外光谱中既包含了木犀草苷的信息，也包含有锌掺杂二氧化硅吸附剂中的成分、样品基质等干扰。通过Matlab 程序实现以上各种光谱预处理和PLS定量模型的建立，表1中显示的是各种光谱预处理后得到的木犀草苷定量模型的预测能力，每一种预处理方法所得的定量预测模型分别通过三个参数：预测残差值(RPD)、交叉验证均方根误差(RMSECV)和相关系数R检验。木犀草苷的预测浓度与实际浓度之间的相关性是由R体现的，预测浓度与实际浓度的偏离程度则是由RMSECV来体现的。根据之前发表的文献表明，光谱预处理方法得到的定量校正模型可以应用在定量预测的前提是RPD大于2.5，RPD 越大得到的定量结果越准确[29]。与无处理方法作比较，从表1 的结果可以看出，样品的光谱经CWT、一阶导数(1st ) 、二阶导数(2nd ) 、SNV +CWT、SNV+1st 处理后，校正模型的R值减小、RMSECV 值增大、RPD 值减小，表明这些与处理方法可以有效改善定量结果； 而经过MSC、MSC+CWT、SNV、MSC+1st方法处理后，模型与无处理方法相比，R值增大，RMSECV 误差减小，RPD 值增大，这四种光谱预处理方法结果表明背景干扰均得到一定消除，这些结果表明对木犀草苷的定量预测能力有所提高。为了让预测的结果更准确，我们选择了SNV 方法让选择误差最小，RPD值最大来处理全部样品的近红外光谱。研究表明，样品微粒分布不均匀及微粒体积不同产生的散射会使光谱中含有大量干扰信息，而SNV作为一种常用的光谱校正和增强技术，它可以校正样品散射产生的光谱误差，从而产生更好的校正和预测性能[30]。

表1 木犀草苷PLS 模型及交叉验证的结果

2.4.2 木犀草苷定量模型的论证

为了检验定量校正模型的预测结果，我们用了22 个外部预测集样品(9 对重复样本)检验了所建立的偏最小二乘模型。预测集样品使用了和校正集样品一样的光谱测量条件、制备方法、建模方法。图7显示了预测集样品(实心圈)和校正集样品(虚心圈)的关系图，图上的参考浓度体现了两种样品集中偏最小二乘模型中参考浓度与预测浓度两者的拟合关系，以 HPLC测定的结果为准，图7结果得到预测均方根误差(RMSEP)为0.6498 mg·L-1，预测集相关系数为0.9909，木犀草苷预测集样本回收率的范围在87%～118%内，说明木犀草苷校正模型对预测集样品有较好的预测结果，模型稳健有效。上述实验结果说明，虽然存在吸附剂、样品基质的干扰，但经过对近红外光谱的标准正态变换(SNV) 法预处理，仍能够采集样品光谱中木犀草苷的定量信息，能够较为准确地测定雪菊提取液中的木犀草苷。

图7 木犀草苷参考浓度和预测浓度相关关系Fig 7 Relationship of predicted concentration and the reference values of luteoloside

3 结 论

(1)通过简单温和的方法实现了锌掺杂二氧化硅吸附剂的制备，吸附实验发现，该吸附剂对木犀草苷具有良好的吸附效果。在红外光谱表征后，将它作为用于雪菊提取液中木犀草苷的富集与近红外光谱检测的吸附剂。

(2)把木犀草苷当作分析对象，考察了吸附剂时间、质量和pH 对吸附能力的影响，结果表明在吸附剂质量为0.25 g，中性条件下常温振荡吸附20 min 时，对木犀草苷的吸附率接近90%，表现出吸附剂对木犀草苷的检测灵敏度有所提升。

(3)使用近红外漫反射光谱结合化学计量学对雪菊中的木犀草苷进行定量分析。分析结果表明，用SNV 对近红外光谱进行预处理效果最好，并且使用了PLSR方法建立木犀草苷的定量校正模型。其中用22个样本(9 对重复样本) 当作预测集对回归模型的准确性实行了验证。在较低浓度范围0.05～15.0 mg·L-1内，预测集相关系数为0.9909，预测集样本的回收率在87%～118%之间，实现了雪菊提取液中木犀草苷微量级的定量预测。