基于GEO芯片联合网络药理学探讨当归饮子治疗慢性荨麻疹的cross-talk及miRNA-mRNA机制*

包成通，魏歆然，张依依，钟 峰，匡泓俊，牛子青，刘小娟，王 璐，李俊熙，章 薇△

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

慢性荨麻疹（CU）[1]是因皮肤黏膜的小血管短暂通透性增加，而出现局限性水肿的一种常见慢性疾病，以易反复发作，迁延不愈，难以根治为主要特征，以皮肤风团、瘙痒、水肿等为主要临床表现，发病机制主要与自身免疫、感染、炎症反应等相关。CU属中医学“白疹”“瘾疹”“风疹”等范畴[2]，病机总属本虚标实，与血虚风燥相关，气血亏虚，卫外失护，开泄失度，外邪（风邪为主）乃入；气血阻滞，精液不畅，布达难荣，化燥生风，风盛则瘙痒，正邪交争于皮肤腠理，发为瘾疹[3]。当归饮子出自《重订严氏济生方》[4]，由荆芥、黄芪、白蒺藜、何首乌、防风合四物汤组成，具有养血和营、祛风止痒之功，皮肤疥疮，或痒或肿，或脓或发赤者适用，临床上治疗CU具有较好疗效，主要与调节免疫、抑制炎症反应有关，但深层机制尚不明确。本研究基于生物信息学技术，采用GEO芯片联合网络药理学的方法，初步探讨当归饮子治疗CU的cross-talk及miRNA-mRNA深层机制，为后期实验及临床验证提出理论现实依据，为CU的临床治疗提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 慢性荨麻疹差异基因分析 以慢性荨麻疹“Chronic Urticaria”为检索词，在NCBI基因表达GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中检索，获取GSE57178芯片表达数据集，该数据集中包括6个病变皮肤样本，7个非病变皮肤样本，5个正常皮肤样本。本研究采用R语言“limma”包对比分析6个病变皮肤样本（GSM1376737、GSM1376739、GSM1376741、GSM1376743、GSM1376745、GSM1376747） 与 5个正常皮肤样本 （GSM1376750、GSM1376751、GSM 1376752、GSM1376753、GSM1376754），以│logFC│>1；P-value<0.05为筛选条件，筛选出慢性荨麻疹的差异基因（Differential Expression Genes；DEGs），并绘制DEGs火山图。

1.2 当归饮子治疗慢性荨麻疹潜在靶点筛选 通过TCMSP[5（]http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）数据库，以口服生物利用度（OB）≥30%；药物类药性（DL）≥0.18为筛选条件[6-7]，获取当归饮子中药有效成分。

通过PubChem[8（]https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库收集当归饮子中药有效成分SDF结构式。

通过Swiss Target Prediction[9（]http：//www.swis stargetprediction.ch/）数据库，将当归饮子中药有效成分SDF结构式导入，获取当归饮子潜在靶点。

通过R语言“VennDiagram”包绘制当归饮子潜在靶点与慢性荨麻疹DEGs韦恩图，以获取当归饮子治疗慢性荨麻疹的潜在靶点。

1.3 当归饮子治疗慢性荨麻疹潜在靶点PPI网络构建及拓扑分析 通过String[10（]https：//string-db.org/）数据库，导入当归饮子治疗慢性荨麻疹的潜在靶点，获取PPI网络相关信息，采用Cytoscape 3.7.2软件对PPI信息进行网络可视化。采用“Network Analysis”对PPI分析，设定 0＜Degree≤5 为“粉红色”；5＜Degree≤10 为“蓝色”；10＜Degree≤15“大红色”；“Degree”值越大则节点越大，可信分数越高则线条越粗；“Combined Score”值越大，边越粗。采用“CytoHubba”对 PPI进行“Closeness”、“Betweenness”、“MCC”拓扑分析，以筛选出当归饮子治疗慢性荨麻疹的关键靶点（Hub-gene）。

1.4 当归饮子治疗慢性荨麻疹的cross-talk机制初探通过DAVID[11]（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）数据库，导入当归饮子治疗慢性荨麻疹的潜在靶点，获取KEGG富集分析数据。采用R语言“ggplot2”包，以富集倍数为横轴；通路为纵轴；-lgP为颜色；基因数为气泡大小绘制KEGG富集分析气泡图。从当归饮子治疗慢性荨麻疹的KEGG通路中，筛选出荨麻疹最相关通路，采用R语言“circlize”包绘制“基因—KEGG”弦图，以寻找出当归饮子治疗慢性荨麻疹关联性最强的通路靶点，同时采用 R语言“UpSetR”包绘制“基因—KEGG”UpSet图，以筛选出当归饮子治疗慢性荨麻疹的具体cross-talk通路靶点。

1.5 当归饮子治疗慢性荨麻疹的miRNA-mRNA机制初探利用TargetScan[12]（http：//www.targetscan.org/mamm_31/）数据库反向预测当归饮子治疗慢性荨麻疹潜在靶点mRNA的miRNA，筛选并收集保守性miRNA，同时利用Cytoscape 3.7.2软件构建miRNA-mRNA相互作用网络调控模式。设定miRNA为方块、灰色；mRNA为菱形、红色。

2 结果

2.1 慢性荨麻疹差异基因分析结果 采用R语言limma包对GEO芯片进行差异分析，以│logFC│>1；P-value<0.05为筛选条件获取DEGs，分析出257个差异基因，其中240个基因表达上调（如：HIF1A、MMP12、STAT3等）；有17个基因表达下调（如：FABP7、KRT15、LGR5 等）。以“logFC”为横轴，“-lgP”为纵轴，差异上调基因设为“红色”，差异下调基因设为“蓝色”，绘制 DEGs火山图（图 1）。

图1 慢性荨麻疹差异基因火山图

2.2 当归饮子治疗慢性荨麻疹潜在靶点筛选结果 通过TCMSP、TCMID数据库，共获取当归饮子中药有效成分共202个，其中黄芪15个（如：Mairin、Jaranol、Bifendate等），白芍 13个（如：Paeoniflorgenone、Lactiflorin、beta-sitosterol等），川芎 7个（如：Wallichilide、Perlolyrine、Myricanone等），当归 2 个（如：beta-sitosterol、Stigmasterol），防风 18 个（如：Anomalin、Divaricatacid、Ammidin等），何首乌 73个（如：beta-sitosterol、Tricin、Rhein等），蒺藜 12个（如：Terrestriamide、Isorhamnetin、Sitosterol等），荆芥 11个（如：Diosmetin、Sitosterol、Schizonepetoside B 等），生地黄 51个（如：Acteoside、Daucosterol、Glutinoside等）。

通过PubChem、Swiss Target Prediction数据库，对上述202个当归饮子中药有效成分进行靶点预测，去除重复值，保留唯一值后，共获取964个当归饮子潜在靶点。采用R语言“VennDiagram”包绘制当归饮子潜在靶点与慢性荨麻疹DEGs韦恩图（图2），获取36个当归饮子治疗慢性荨麻疹的潜在靶点（表1）。

图2 当归饮子潜在靶点与慢性荨麻疹DEGs韦恩图

表1 当归饮子治疗慢性荨麻疹的潜在靶点

2.3 当归饮子治疗慢性荨麻疹潜在靶点PPI网络构建及拓扑分析结果 通过String数据库，采用Cytoscape 3.7.2软件对PPI信息进行网络可视化及网络分析（图3），该PPI网络中，共有36个节点，91条边，P<1.0e-16，平均节点度为5.06，平均聚类系数为0.584。根据 Degree 值排序显示：ITGB2＞TLR4＞STAT3＞VCAM1＞10，表示此4个靶点在当归饮子治疗慢性荨麻疹中作用最强。同时采用“CytoHubba”对PPI进行“Closeness”、“Betweenness”、“MCC”拓扑分析（图 4），以筛选出 Hub-gene（表 2）。

图3 当归饮子治疗慢性荨麻疹潜在靶点PPI网络图

表2 当归饮子治疗慢性荨麻疹Hub-gene

图4 当归饮子治疗慢性荨麻疹潜在靶点拓扑分析网络图

2.4 当归饮子治疗慢性荨麻疹的cross-talk机制 通过DAVID数据库，获取KEGG富集分析数据，采用R 语言“ggplot2”“circlize”“UpSetR”包，分别绘制“基因—KEGG”气泡图、弦图、UpSet图。当归饮子治疗慢性荨麻疹潜在靶点共富集17条KEGG通路，如气泡图所示（图5A）：NF-kappa B通路、HIF-1通路、TNF通路等。通路富集的基因靶点，如弦图所示 （图 5B）：NF-kappa B 通路由 LYN、VCAM1、TLR4、ICAM1基因靶点富集；HIF-1通路由STAT3、HIF1A、TLR4基因靶点富集；TNF通路由VCAM1、SELE、ICAM1基因靶点富集等。cross-talk是通路共同基因靶点相互“串话”，激活2条以上通路，介导一种或多种表型的机制模式，当归饮子治疗慢性荨麻疹潜在靶点中cross-talk机制如UpSet图所示（图5C）：1个靶点（SELE）在TNF通路与细胞粘附分子（CAMs）2条通路中“串话”；1个靶点（ITGB2）在吞噬体与CAMs 2条通路中“串话”；2个靶点（CTSL、CTSS）在抗原处理表达、吞噬体与溶酶体3条通路中“串话”；2个靶点（VCAM1、ICAM1）在 NF-kappa B、TNF与CAMs 3条通路中“串话”；1个靶点（TLR4）在 HIF-1、NF-kappa B、吞噬体 3条通路中“串话”。

图5 当归饮子治疗慢性荨麻疹“基因—KEGG”气泡图（A）、弦图（B）、UpSet图（C）

2.5 当归饮子治疗慢性荨麻疹的miRNA-mRNA机制 TargetScan数据库反向预测当归饮子治疗慢性荨麻疹的miRNA，其中36个潜在靶点中，共有24个潜在靶点 mRNA（如：TLR4、HIF1A、STAT3等）存在保守 miRNA（如：miR-140-5p；miR-542-3p；miR-489-3p等）调控，构成了477组miRNA-mRNA模式（如 ：miR-140-5p-TLR4；miR-199a-5p-HIF1A；miR-370-3p-STAT3等），相互作用结果如图6。

图6 相互作用结果

3 讨论

cross-talk即“串话”[13]，原指通信线路上信号杂散耦合到其他通信线路造成干扰的现象，在细胞信号通路相关研究中，认为细胞间信号通路是一个复杂的网络体系，单一信号通路在一定条件下会受到其它信号通路的影响，从而产生了细胞生物学界的“信号串话”。 miRNA[14]是微小的非编码RNA，主要通过结合靶mRNA的3’非翻译区（UTR），导致靶mRNA进行切割或转录抑制。在CU的治疗中cross-talk与miRNA-mRNA机制是当前的热点问题。

当归饮子由荆芥、黄芪、白蒺藜、何首乌、防风、当归、川芎、白芍、生地黄组成，方中四物汤养血活血，补通同用；何首乌养血滋阴，祛风止痒；黄芪益气实表，托毒行滞；白蒺藜、防风、荆芥散风邪以止痒，全方共奏养血、滋阴、润燥、祛风之功，善治CU之血虚风燥证。当归饮子治疗CU血虚风燥证具有较好的疗效，且在实验中得到广泛验证，叶静静[15]对168例CU患者进行RCT，发现当归饮子能显著降低患者血清中MDA含量，抗氧化应激以提高免疫，从而降低CU复发率，改善患者瘙痒、水肿等症状。徐风等[16]研究证实当归饮子能下调LC3II、p62表达，促进自噬小体形成，改善CU水肿及毛细血管扩张，但其深层机制尚未明确，需待进一步研究。

本研究旨在利用生物信息学算法研究当归饮子治疗CU的cross-talk及miRNA-mRNA机制。GEO芯片差异分析出257个差异基因，240个基因表达上调，17 个基因表达下调（如：FABP7、KRT15、LGR5等）。网络药理学方法分析出当归饮子有效成分及潜在靶点共964个，取潜在靶点与差异基因交集后得到36个当归饮子治疗CU的潜在靶点；对筛选分析出的当归饮子治疗 CU的潜在靶点进行 PPI、KEGG、cross-talk及miRNA预测分析，以初步明确当归饮子治疗CU的分子机制。

当归饮子治疗CU的PPI网络分析中，有36个节点（基因），91条边，拓扑分析出 TLR4、STAT3、ITGB2等18个关键基因，能初步认为此18个基因可能在当归饮子治疗CU中作用最强。研究发现CU患者外周血中TLR4显著升高，TLR4能诱导IL-6和MIP-1α分泌，介导CU患者免疫炎症反应[17]，同时研究发现当归饮子中有效成分当归多糖[18]在多种疾病中能抑制TLR4表达[19-20]，抑制炎症反应。Luo等[21]研究发现CU患者皮肤组织中JAK2/STAT3信号通路被激活，炎症细胞增殖，此过程能被OSMR能被抑制，同时王丽新[22]提出STAT3是检测CU临床疗效的潜在客观指标之一。因此可认为36个当归饮子治疗CU的靶点中的18个可作为潜在的临床疗效标志物及治疗靶点。

cross-talk是通路共同基因靶点相互“串话”，激活2条以上通路，介导一种或多种表型的机制模式，本研究以KEGG富集分析为切入点，结合关联性弦图及UpSet图，将筛选出的“通路串话”靶点进行可视化（如：TLR4可能在HIF-1、NF-kappa B、吞噬体3条通路中“串话”等）。Pei等[23]研究发现IL-38能通过HIF-1与NF-kappa B信号通路，降低HIF-1α、NFΚB p65与TLR4表达，抑制炎症反应，在大鼠模型中初步验证了TLR4可能参与HIF-1与NF-kappa B信号通路之间的串话，在炎症反应中发挥作用。Hu等[24]研究发现内皮细胞表面的双链蛋白聚糖（BGN）与其受体TLR2、TLR4结合，激活HIF-1与NF-kappa B信号通路，增强HIF-1α、NF-κB启动子之间的相互作用，从而刺激下游VEGF表达。本研究构建的cross-talk“通路串话”机制模式，虽已有部分在实验中验证，但仍有大量的cross-talk模式尚未研究，因此不仅可作为当归饮子治疗CU的分子机制，而且也为其他疾病的治疗提供了新的思路。

miRNA是一类广泛存在于动植物中，对转录后基因表达调控起关键作用的内源性小非编码RNA。成熟miRNA先与RNA诱导沉默复合体（RISC）的复合物结合，再特异性与下游靶mRNA的3’UTR形成不完全互补配对，阻断转录后翻译，从而调控基因表达，此过程称为miRNA-mRNA互作模式。本研究初步筛选出TLR4、HIF1A、STAT3在内的24个潜在靶点的477组miRNA-mRNA模式（如：miR-140-5p-TLR4；miR-199a-5p-HIF1A；miR-370-3p-STAT3等）。Ching-Kow等[25]通过miRNA微阵列技术发现CU患者中有16种差异miRNA（DEMs），其中5个miRNA（miR-2355-3p、261-3p、4264、2355-5p、29c-5p）与7个上调mRNA（FBXL20，OPHN1，YPEL2，STARD9，SELE，KLHL24，ING4） 相互作用明显，对CU疾病的诊断与治疗提出了指导性的建议，构建的miRNA-mRNA模式中与本研究筛选的miR-6835-3p-SELE、miR-6893-3p-STAT3；miR-140-5p-TLR4等相互吻合，因此本研究构建的当归饮子治疗CU的miRNA-mRNA模式能成为后续实验验证的潜在分子机制模式。

综上所述，本研究采用GEO芯片联合网络药理学的方法，筛选出当归饮子治疗CU的关键靶点，构建了蛋白相互作用的PPI网络，并进一步从通路、cross-ralk、miRNA-mRNA机制角度得出当归饮子治疗CU可能通过 TLR4参与的HIF-1、NF-kappa B、吞噬体3条通路中“串话”机制发挥作用，同时miR-140-5p-TLR4的相互作用关系可能在其中发挥重要作用，同时得出当归饮子治疗CU的多靶点、多cross-ralk、多miRNA-mRNA机制将成为未来机制研究的新方向。本研究从基因、分子角度预测和分析了当归饮子治疗CU的作用机制，为后续研究提供了依据。