PCR 快速检测食品中牛源性成分

2020-12-08肖明雅冯娜娜

今日畜牧兽医 2020年10期

肖明雅，冯娜娜，陈阳，尹锐

（吉林农业科技学院生物与制药工程学院 132101）

1 引言

食品中动物物种成分的正确标注，可提升食品安全、食品质量，增强消费者的消费信心、维护商业公平，保障食品行业的健康发展。当今社会，食品生产、加工和流通链条较长，使得食品掺假的机会明显增多。一些不法商家为了谋取暴利，将价格较低的肉掺入价格较高的肉制品中出售[1]，如以鸡肉冒充猪肉，猪肉冒充牛羊肉[2]。更为严重的是近几年频频曝出了“利用老鼠、狐狸、水貂肉添加明胶、胭脂红等冒充牛肉”[3]等。因此，建立一种准确、快速、灵敏的食品中牛源性检测技术势在必行。

基于蛋白质[4-6]和基于DNA 技术[7-12]的检测是动物物种鉴定的主流方法。蛋白质检测方法简单易行，但是食物中的蛋白质经深加工和热处理易发生变性而无法检出。与蛋白质相比，DNA 具有较高的热稳定性和物种特异性，可对不同深加工方式的食物中的物种成分有效检出[13,14]。因此，越来越多的检测手段开始着眼于DNA 水平检测的研究。

PCR 法和实时荧光定量PCR 技术由于检测快速、灵敏性高、特异性好等优势，被更多的用于动物物种的检测研究[15-20]。根据PCR 检测基本原理，本研究对待测引物及探针进行独特设计，以牛源性成分的快速检测为切入点，建立了一种食品中牛源性成分PCR 快速检测方法。该方法具有快速、灵敏度高、特异性强[21,22]等优点，以期成为一种新型的物种成分快速分子检测工具，在牛源性成分检测、掺假鉴定及物种溯源过程发挥重要作用。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

2.1.1 材料与试剂

琼脂糖、DNA 分子量标准Marker A（25～500bp）、磁珠法动物基因组DNA 提取试剂盒、PCR 预混液（上海生工生物工程股份有限公司）。

实验样本于长春某大型超市选购，包括牛肉、羊肉、鸡肉、猪肉、鸭肉、鱼肉及28 份商业样品。

2.1.2 主要仪器设备

TG16KR 台式高速冷冻离心机（上海继谱电子科技有限公司）；PCR-MGL96+普通PCR 仪（日本岛津公司）；SCANDRPO 100超微量核酸蛋白测定仪（德国耶拿分析仪器股份公司）；E-Gel Imager 核酸凝胶成像系统（赛默飞世尔科技有限公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 样品DNA 提取及纯度检测

将每个肉的样品切碎并精确称重；每个样品按动物基因组DNA 提取试剂盒提取0.1g，然后根据试剂盒说明书步骤进行样本DNA 的提取。 DNA 样品的完整性用1%琼脂糖凝胶电泳法鉴定；样品的纯度用超微量核酸蛋白测定仪在OD260/OD280 处的吸光度值来确定，数值在1.7～1.9 的可用于PCR 反应。

2.2.2 引物的设计

从国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI) 网站下载牛和其他动物物种的线粒体DNA 序列。物种线粒体基因组Genbank 号如下：

Bos taurus (GU947021，AY126697，FJ997262，KR011113，NC_036020)，Equus caballus (AP013085，AY584828，KT368757)，Equus asinus (MK982180)，Ovis aries (KU575248，KF312238，KX609626)，Capra hircus (MK234706，MH229952)，Sus scrofa(KY964306，MK251046，GU147934，MK248682)，Canis lupus familiaris (CM016608，KT591870，EU408280)，Gallus gallus (KX987152，GU261718)，Pandalus borealis (FJ403244)，Austruca lactea (NC_042401)，Parasesarma affine(NC_039990)，Anas platyrhynchos (MF069251，EU755252）。对这些序列通过Vector NTI Advance11.0 进行分析(Ink/Thermo Fisher Scientific Carsbad，CA，USA)，进行多序列比对，选用跨牛线粒体基因组的ND5-ND6基因（烟酰胺嘌呤二核苷酸（nicotinamide dinucleotide，NADH）脱氢酶亚基5 和NADH 脱氢酶亚基6 编码基因）设计引物。使用DNAStar 软件对候选引物的物理参数进行评估。使用BLAST 工具(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对引物的特异性进行验证。引物由生工（上海）生物工程有限公司合成。序列如表1。

表1 引物序列

2.2.3 PCR 扩增及电泳检测

PCR 反应体系25μL 包含5.2μL PCRMIX、上下游引物各0.8μL(10μmol/L)、1μL 的DNA 模板和17.2μL 的ddH2O。 PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30sec；56℃退火30sec；72℃延伸30sec，40 个循环。取5μL PCR 扩增产物用于2%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为电压100V，电流80mA；30min 后凝胶成像仪分析结果。

2.2.4 检测的特异性

提取牛肉、羊肉、鸡肉、猪肉、鸭肉、鱼肉基因组DNA，以ddH2O 为阴性对照。应用牛源性成分特异引物进行扩增，琼脂糖凝胶电泳进行检测，实验重复3 次。验证反应的特异性。

2.2.5 检测的灵敏度

研究采用琼脂糖凝胶电泳评价PCR 检测技术的灵敏度。将纯化的牛基因组DNA 进行梯度稀释，呈1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg 和1fg 7 个浓度，分别以各浓度的DNA 作为模板进行PCR 扩增；通过琼脂糖凝胶电泳来确定该检测的灵敏度。上述实验重复3 次。验证检测的灵敏度。

2.2.6 实际样品的检测

从超市购买标明成分的25 份牛肉及猪肉制品，按2.2.1 方法提取其基因组DNA，通过牛源性PCR-电泳检测以评价其在实际样本检测中的适用性。