某种鸡场传染性喉气管炎病毒的分离与鉴定

李玉燕，巩新民，祝永华，左常魁，丁爱君，包丹丹，江 兵，李 月，郭龙宗

(山东益生种畜禽股份有限公司，山东 烟台 264680)

传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)是鸡的一种病毒性的呼吸道传染病，该病能引起鸡的死亡率和产蛋量下降，给生产带来严重损失[1]。其中种鸡的ILT 发病呈世界性分布，世界上许多国家都有该病的发病报道[2-3]，该病在我国近几年也呈流行趋势，不断有养殖场发生传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus, ILTV)感染的报道[4-6]。2019年6月，某种鸡场鸡群在8周龄时开始出现呼吸道症状，听鸡有呼噜声、呼吸困难、伸颈喘气、咳嗽、怪叫。临床剖检死鸡发现眼部周围有黄色干酪样渗出，喉头、气管内出血，黏液增多，部分鸡只气管内有血块，疑似传染性喉气管炎病毒感染。该鸡群未进行传染性喉气管炎病毒免疫。笔者采集死亡鸡只气管、肺、喉头等组织样品进行病毒的分离与鉴定，鸡胚绒毛尿囊膜接种、琼脂扩散试验和PCR鉴定结果显示，该种鸡群发病为ILTV感染。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 PCR引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成；EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取试剂盒、PCR反应试剂盒、2 000 bp Marker、琼脂糖、TAE，均购自北京全式金生物技术有限公司。ILTV标准阳性血清，购自中国兽医药品监察所。ILTV疫苗株作为阳性对照，购自英特威公司，批号为94150010，有效期至2020年8月13日。SPF鸡胚，购自山东益吉达生物科技有限公司。

1.2 病料处理 采集该种鸡场疑似ILTV感染鸡只的气管、肺、喉头等病料，加入灭菌生理盐水研磨，直至成5%～10%的匀浆液，加入青霉素、链霉素4 ℃作用2 h，冻融3次。将悬液移至离心管中充分摇震后，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤除菌，用于接种鸡胚。

1.3 病毒分离 将经0.22 μm滤膜过滤除菌的滤液经绒毛尿囊膜(CAM)接种15枚10日龄SPF鸡胚，每枚接种0.2 mL滤液，同时设生理盐水对照组。37 ℃孵化箱孵育6 d，每天照蛋2次，观察鸡胚死亡情况，弃去24 h内的死胚。于接种后第6天收集鸡胚绒毛尿囊膜，观察是否有痘斑。若第1代有痘斑，将鸡胚绒毛尿囊膜研磨制成匀浆，反复冻融3次，离心取上清，置-20 ℃保存备用，用于提取DNA。若第1代没有痘斑，按照同样方式继续传至第3代。

1.4 琼脂扩散试验 用标准的ILTV阳性血清作为琼脂扩散试验抗体加入梅花孔中央，分离病毒毒株作为琼脂扩散试验抗原加入周围孔。在1.5%的琼脂板上，按照常规方法打孔、加样，置37 ℃湿盒中24 h，观察结果。

1.5 核酸提取 采集有痘斑病变的鸡胚绒毛尿囊膜经研磨离心后，取上清液按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit使用说明书提取DNA。

1.6 样品的鉴定

1.6.1 引物 设计合成针对ILTV的通用PCR检测引物，上游引物序列为：5′-GAGTTCGAGAACGATGACTC-3′，下游引物序列为：5′-AGGCAGATGTACGAGTTAGG-3′，扩增目的片段大小为530 bp。

1.6.2 目的片段的扩增 PCR反应体系25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、模板DNA 3 μL、ddH2O 7.5 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存备用。取7 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像仪中观察并记录结果。

2 结果

2.1 临床症状 某种鸡场鸡群在8周龄开始出现呼吸道症状，听鸡有呼噜声、呼吸困难、伸颈喘气、咳嗽、怪叫。该鸡群未免疫传染性喉气管炎疫苗。临床剖检死鸡发现眼部下方有黄色干酪样渗出物，气管内出血，严重者气管内有出血斑块，肺脏有大量黏液，疑似传染性喉气管炎病毒感染。

2.2 ILTV的病毒分离 将气管、肺、喉头等病料组织上清液过滤除菌后，经绒毛尿囊膜(CAM)方式接种SPF 鸡胚，第1代孵化鸡胚于72 h内死亡2枚，其余鸡胚一直孵化至第6天，未有死亡。未死亡鸡胚4 ℃冻存过夜后，取CAM进行观察，结果发现CAM增厚，有大小不等的白色、不透明痘斑出现，中间凹陷坏死。

2.3 ILTV的琼脂扩散试验 将分离ILTV出现痘斑病变的CAM的研磨液作为待测抗原，其和标准阳性血清之间出现明显的沉淀线，可以确诊所分离的病毒为ILTV。

2.4 ILTV 的 PCR鉴定 采集有痘斑病变的鸡胚绒毛尿囊膜提取DNA，进行ILTV的PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增出530 bp的目的条带(见图1)，符合预期片段大小，可以确诊所分离的病毒为ILTV。

图1 有痘斑病变的鸡胚绒毛尿囊膜的ILTV的PCR鉴定

3 讨论

本试验采集该种鸡场鸡群疑似感染ILTV鸡只的喉头、气管和肺等病料进行病毒分离，经鸡胚绒毛尿囊膜接种、琼脂扩散试验和PCR扩增对分离病毒进行鉴定。结果表明，所分离病毒为鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)。该鸡群在疑似感染ILTV后，立即进行ILT紧急免疫，未造成严重经济损失，死亡率为0.6‰(1万只鸡死亡6只)。规模化养殖场ILT的防控主要以疫苗免疫接种为主，感染压力小的地区种鸡群一般在100日龄左右免疫1次可使鸡群获得终生的保护力，免疫方式以滴眼为主。该种鸡群ILT发病周龄小，这在集约化养殖场中第1次发现，也为场区的生物安全防控敲响了警钟。因此，在种鸡群免疫ILT前应加强场区的生物安全防控措施，包括场区的物资、车辆、人员的消毒管理以及鸡舍通风等方面，防止ILTV在种鸡群免疫前侵入鸡群。