慢病毒介导酪氨酸激酶受体A过表达载体促进神经干细胞增殖和分化的实验研究

邓明，谢萍，马永刚，周炎，贺斌，陈庆，吴飞，陈忠辉，明江华

作者单位：1武汉大学人民医院骨科，湖北 武汉430060；2武汉市第三医院中医科，湖北 武汉430060

脊髓损伤是临床上常见的中枢神经系统的损伤，多由高能量损伤引起，比如车祸伤，高处坠落伤等［1-2］。脊髓损伤具有较高的致残率，是临床上的治疗难点，虽然治疗方式很多，但是效果一直不理想［3］。因此，寻找一种安全有效的治疗方案是十分必要的。神经干细胞可以从小鼠的纹状体和脊髓中获得，因其多分化潜能一直备受人们的关注［4-5］。也有学者将神经干细胞直接注射入小鼠脊髓损伤模型中，但是修复效果不理想，原因可能有二，第一，神经干细胞数量较少，增殖能力较弱；第二就是分化能力差，神经干细胞分化的神经元细胞功能较差，不能满足需要［6-7］。所以寻找一种促神经干细胞增殖和分化的方案是临床需求所在。

酪氨酸激酶受体A（Tyrosine kinase receptor A，Trk A）与神经元细胞的存活和分化密切相关［8］，在海马、新皮质等部分均可以检测到Trk A的表达，而且含量较高［9-10］。也有研究证明，Trk A与大脑的记忆功能密切相关［11］。因此，本研究于2018年1月至2019年1月通过siRNA技术构建Trk A的过表达载体，通过慢病毒进行转染神经干细胞，观察其对神经干细胞促增殖和分化作用。

1 材料与方法

1.1实验材料改良Eagle培养基（DMEM）培养基和Hank’s液均购于美国Gibco公司；胎牛血清（FBS）购于以色列BI公司；兔抗鼠Brdu及Nestin单克隆抗体购于Abcam公司；慢病毒的提取和Trk A的过表达载体的构建由上海吉凯公司提供；MTT试剂盒购于Trizol提取试剂盒，Takara逆转录试剂盒和Takara荧光定量PCR试剂盒购于日本Takara公司；AV-PI试剂盒购于联科生物有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 神经干细胞的提取和培养 取新生SD雌性大鼠10只，体质量（23.0±3.2）g，月龄为（4.4±0.8）月，符合SPF清洁级动物指标，动物合格证号：2009A047，购于济南动物实验研究中心，许可证号：SCXK鲁20190001。本研究符合一般动物实验伦理学原则。常规消毒后，采用断颈法处死SD大鼠，眼科剪分离SD大鼠脑组织，取海马组织，Hank’s液清洗3遍，研磨棒研磨均匀，加入磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液），制备细胞悬液，4℃低温高速离心机16 000 r/min离心5 min，取沉淀物，加入含20%FBS的DMEM培养基，制备细胞悬液，接种于25 mL的无菌培养瓶中。置入37℃、体积分数5%二氧化碳下培养，3 d换液1次，待细胞融合率达80%以上时进行细胞传代。

1.2.2 神经干细胞的鉴定 本研究采用免疫荧光的方法对神经球进行鉴定，取第3代神经干细胞，胰蛋白酶消化后加入含20%FBS的DMEM培养基，对胰蛋白对进行拮抗，普通离心机5 000 r/min离心5 min，取沉淀物，加入含20%FBS的DMEM培养基，制备细胞悬液，接种于24孔玻璃板中，待细胞融合率为50%左右时，去掉培养基，PBS溶液清洗3遍，加入5%甲醛溶液固定20 min，PBS溶液清洗3遍，加入20%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）进行透膜处理，PBS溶液清洗3遍，加入兔抗鼠Brdu及Nestin单克隆抗体，避光4℃过夜处理（＞12h），PBS溶液清洗3遍，加入含CY3（红色）和GFP（绿色）荧光二抗，避光孵育30 min，倒置荧光显微镜下观察。

1.2.3 Trk A的过表达载体的构建 Trk A的过表达载体的构建和筛选由上海吉凯公司完成。首先对目的基因进行过表达引物设计，设计序列为：TrkA（4589-11）：P1：ACGGGACTAAGCGCATTGCAATTTCC；Trk A（4589-11）：P2：GAATCGCGTTGCATGCCGTAA。然后RT-PCR扩增目的基因序列，将目的基因扩增序列加入线性化表达载体，选取上海吉凯公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒载体作为酶切对象，加入Trk A基因过表达载体序列后，转染人胚肾293T细胞，进行克隆测定，然后进行质粒的抽提，慢病毒的包装以备用。

1.2.4 实验分组 将神经干细胞分成三组，即空白对照组，阴性对照组和实验组。空白对照组为未做任何处理的细胞组，阴性对照组是经空白载体的慢病毒转染的细胞组，实验组是由Trk A的过表达载体构建的慢病毒转染细胞组。

1.2.5 逆转录PCR（RT-PCR）检测Trk A和神经分化基因Tuj1、GFAP、CNPase的表达 利用胰蛋白酶收集上述各组细胞（空白对照组，阴性对照组和实验组），经PBS溶液清洗3次，常温离心机1 500 r/min离心5 min，取沉淀，加入1 mL Trizol溶剂，提取细胞总RNA，保证RNA纯度范围为1.8～2.1，然后利用Takara逆转录试剂盒的要求，采用20µL反应体系逆转录为互补DNA（cDNA），-80℃保存，采用Takara荧光定量PCR试剂盒（SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒）的要求，采用FTC-2000 RT-PCR系统和50µg反应体系对样本DNA进行分析，溶解曲线确定Tm值为53.7℃，统计并记录各组样本的CT值，采用2-△△CT法对 Trk A 和神经分化基因 Tuj1，GFAP 和CNPase的表达进行统计。Trk A，Tuj1，GFAP，CNPase和内参基因GAPDH引物设计由上海生工公司设计并检测合格（表1）。

表1 酪氨酸激酶受体A（Trk A）、神经分化基因Tuj1、GFAP、CNPase和内参基因GAPDH引物序列

1.2.6 蛋白质印迹法（Western Blot）检测Trk A，Tuj1，GFAP和CNPase的蛋白表达 慢病毒转染72 h后，收集上述三组细胞，弃掉培养基后，PBS清洗后，加入2 mL RIPA细胞裂解液，冰上孵育45 min，细胞刮收集细胞碎片，加入PE管中，预冷高速离心机，4℃，12 000 r/min，收集总蛋白，加入10µL苯甲基磺酰氟（PMSF），99℃煮沸，BAD试剂盒测定蛋白的分子量。按照说明书，配置10%分离胶和4%浓缩胶，加入50 ng蛋白量，1×十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液浸没胶板，40 V电泳2 h后转染到硝酸纤维素膜，等渗缓冲盐溶液（TBST）洗膜后，过夜孵育Trk A、Tuj1、GFAP和CNPase的蛋白一抗，TBST液洗膜，常温孵育鼠抗山羊辣根过氧化物酶（HRP）二抗30 min，DAB显影，Image J软件分析蛋白条带。

1.2.7 CCK-8试剂盒检测细胞的增殖 利用胰蛋白酶收集上述各组细胞（空白对照组，阴性对照组和实验组），经PBS溶液清洗3次，常温离心机1 500 r/min离心5 min，取沉淀，加入含20%FBS的DMEM培养基5 mL，制成细胞悬液。接种在96孔板中，以每孔5 000个/100微升的接种量接种，按照CCK-8试剂盒的说明书，72 h后每孔加入10µL的CCK-8的试剂，放到37℃，5%二氧化碳浓度的细胞培养箱中培养2 h。使用酶标仪，在450 nm波长处测定吸光度，每组设置3个复孔。

1.3统计学方法应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，结果用形式表示。三组比较采用单因素方差分析，多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1神经干细胞的培养和鉴定结果悬浮培养细胞5 d后，形成神经细胞球；免疫荧光染色显示神经干细胞细胞球Nestin（红色荧光），Brud染色（绿色荧光）阳性，且占细胞量的90%以上；荧光双标染色（棕色荧光）显示双染细胞量占总细胞量的90%以上，说明培养的细胞是神经干细胞。见图1。

2.2 Trk A过表达载体的构建和慢病毒转染以绿色荧光蛋白（GFP）为荧光探针，完成Trk A过表达慢病毒载体的构建。慢病毒转染效率较高，以人胚肾293T细胞为实验对象，慢病毒转染率如图2所示。慢病毒滴度的检测结果：Trk A过表达慢病毒载体转染滴度为3×108TU/mL。

2.3 RT-PCR检测Trk A与神经干细胞分化标志分子的mRNA表达空白对照组和阴性对照组的Trk A与神经分化标志分子Tuj1、GFAP和CNPase的mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05），而实验组的Trk A与神经分化标志分子的mRNA相对表达量要明显高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 逆转录PCR（RT-PCR）检测酪氨酸激酶受体A（Trk A）与神经干细胞分化标志分子的mRNA表达/

表2 逆转录PCR（RT-PCR）检测酪氨酸激酶受体A（Trk A）与神经干细胞分化标志分子的mRNA表达/

注：与空白对照组比较，aP＞0.05；与空白对照组比较，bP＜0.05；与阴性对照组比较，cP＜0.05

CNPase 1.27±0.05 1.12±0.07a 4.69±0.76bc 9.98 0.012组别空白对照组阴性对照组实验组F值P值重复次数3 3 3 Trk A 1.09±0.09 1.11±0.05a 7.12±1.32bc 10.91 0.009 Tuj1 1.12±0.04 1.19±0.06a 3.26±0.98bc 14.23＜0.001 GFAP 1.15±0.07 1.11±0.05a 10.34±2.56bc 18.45＜0.001

2.4蛋白质印迹法检测Trk A与神经干细胞分化标志分子的蛋白表达空白对照组和阴性对照组Trk A以及神经分化标志分子Tuj1，GFAP和CNPase的蛋白表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05），实验组Trk A以及神经分化标志分子的蛋白表达量要明显高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。见图3、表3。

2.5神经干细胞的增殖能力比较结果CCK-8试剂盒检测结果表明，空白对照组、阴性对照组和实验组的细胞增殖率分别为（87.92±9.21）%、（88.22±9.37）%、（176.01±11.33）%（F＝18.45，P＝0.001），其中空白对照组和阴性对照组的细胞增殖率比较差异无统计学意义（P＞0.05），实验组的细胞增殖率要明显高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。

表3 蛋白质印迹法检测酪氨酸激酶受体A（Trk A）与神经干细胞分化标志分子的蛋白相对表达量/

表3 蛋白质印迹法检测酪氨酸激酶受体A（Trk A）与神经干细胞分化标志分子的蛋白相对表达量/

注：与空白对照组比较，aP＞0.05；与空白对照组比较，bP＜0.05；与阴性对照组比较，cP＜0.05

CNPase 147.29±37.87 155.45±29.86a 398.14±30.55bc 37.12＜0.001组别空白对照组阴性对照组实验组F值P值重复次数3 3 3 Trk A 121.12±22.45 128.19±21.33a 476.18±19.32bc 20.76＜0.001 Tuj1 67.12±9.13 70.13±9.08a 95.14±6.22bc 29.78＜0.001 GFAP 109.18±34.09 111.17±38.21a 698.39±20.22bc 30.27＜0.001

3 讨论

在本研究中，主要着眼于神经干细胞的增殖和分化研究，利用siRNA技术构建Trk A的过表达载体，利用慢病毒转染技术，转染神经干细胞，观察其对神经干细胞的增殖和分化作用，此为本研究的创新点。

神经干细胞治疗脊髓损伤是非常有前景的治疗方案，相较于手术和药物治疗，具有明显的优势。神经干细胞对于脊髓损伤的修复具有十分重要的作用［12］。但是神经干细胞的增殖能力弱［13］，分化能力差［14］，单纯的神经干细胞移植对于脊髓损伤的修复作用并不理想。神经干细胞治疗脊髓损伤利用神经干细胞的增殖和分化，促进神经干细胞原位增殖和分化，根据损伤部位的功能需求和周围内环境的要求，神经干细胞可以定向分化为神经元细胞，星形胶质细胞和少突胶质细胞等，从而更好地对脊髓功能进行修复［15-16］。本研究以神经干细胞为研究对象，通过取新生SD大鼠的海马组织，提取和培养神经干细胞，以Nestin和Brud染色［17-18］对神经干细胞进行鉴定，结果证明我们提取的是神经干细胞。然后我们进一步寻找新的方法促进神经干细胞的增殖和分化。

Trk A与神经元细胞的存活和分化密切相关，在海马、新皮质等部分均可以检测到Trk A的表达，而且含量较高［19］。几乎所有的胆碱能神经元都含有Trk A，所以Trk A在胆碱能神经元的分化和成熟过程中起到一定的作用［20］。也有研究证明Trk A与神经生长因子（NGF）相结合，共同促进了神经细胞的再生和干细胞的分化［21］。可见Trk A的表达量增多可以促进神经元细胞的增殖和分化。既往文献表明，Tuj1蛋白是神经元细胞的标志物，GFAP是星形胶质细胞的标志物，CNPase是少突胶质细胞的标志物［22-23］。本研究利用siRNA技术，构建Trk A的过表达载体，通过慢病毒转染神经干细胞，目的是通过促进神经干细胞内Trk A的过表达，观察其生物学行为，结果证明，Trk A的过表达载体不仅可以促进Trk A mRNA水平的表达，还可以促进神经干细胞分化标志分子Tuj1，GFAP和CNPase的表达，从而促进神经干细胞向神经元细胞，星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。另外，本研究也通过CCK-8试剂盒检测了神经元干细胞的增殖，结果表明，Trk A的过表达载体也可以促进神经干细胞的增殖，从而解决了神经元干细胞的增殖能力低下的问题，为神经元干细胞用于脊髓损伤的治疗提供了更多的依据和方案。

然而本研究尚有不足，Trk A过表达载体可以促进神经元干细胞的分化和增殖，但涉及的信号通路机制尚不明确，这也是本研究以后将要进行的工作。

综上所述，Trk A过表达载体可以促进神经元干细胞向神经元细胞，星型胶质细胞和少突胶质细胞的分化，并且可以促进神经元干细胞的增殖。

（本文图1～3见插图12-3）