食品中副溶血性弧菌快速检测技术应用进展

种婷

摘 要：食品安全是关系人民群众生命、健康和社会稳定的重大公共安全问题。自2014年开始，微生物污染就成为了食品安全领域的焦点问题，而这种现象与全球食品安全面临的问题相吻合。近年来，沿海地区和内陆食源性致病菌，特别是副溶血性弧菌引起的食物中毒发生率呈显著上升的势态，开发快速有效的副溶血性弧菌检测技术意义重大。

关键词：副溶血性弧菌;快速检测;MALDI-TOF-MS

Abstract：Food safety is a major public safety issue related to peoples life， health and social stability. Since 2014， microbial contamination has become the major focus in the field of food safety， and this phenomenon is consistent with the global food safety problems. In recent years， the incidence of food poisoning caused by food borne pathogens， especially Vibrio parahaemolyticus， has increased significantly in coastal and inland areas. It is of great significance to carry out rapid and effective detection of Vibrio parahaemolyticus.

Key words：Vibrio parahaemolyticus; Rapid detection; MALEI-TOF-MS mass spectrometer

中图分类号：TS207.4

副溶血性弧菌是一种嗜盐菌，主要分布在河口、海洋及沿海地区，是引起沿海地区细菌性食物中毒的首要食源性致病菌，也是全国食源性疾病微生物病因的主要病因[1-2]。食品中副溶血性弧菌的检测主要分为常规检测和快速检测两种方法。常规检测准确、可靠，但周期较长，操作繁琐，当食源性疾病爆发时，无法快速鉴定出结果，无法满足食品市场快速检测的需要。因此快速检测技术得到越来越多食品检测人的青睐，并且逐渐取得权威检测机构认可，其中发展较快的有免疫学、生物化学和分子生物学方法等，这些新技术应用于副溶血性弧菌的快速检测中，不仅精确性高、特异性强，而且方便快捷，可以满足现代快速检测的需要。

1 副溶血性弧菌的免疫学检测法

1.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫法其主要原理是抗原和抗体的特异性反应，载体上的酶与底物发生显色反应，通过分光光度计对显色反应进行测定。其特点是检测快速、特异性好、通量高、灵敏度高，在食品副溶血性弧菌快速检测中发挥了巨大作用。杜玉萍等[3]对不耐热溶血素的基因进行克隆，并对其编码的不耐热溶血素蛋白进行纯化和表达，从不耐热溶血素蛋白免疫小鼠中提取抗不耐热溶血素抗体，同时利用大白兔的抗副溶血性弧菌抗体建立酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法，直接测定该菌的致病性，从而间接反映出副溶血性弧菌的不耐热溶血素基因具有较强的特异性，该方法检测不耐热溶血性毒素的灵敏度为8～10 μg·mL-1。检测不耐热溶血素的特异性基因可以为该菌的感染情况提供有力依据。

1.2 免疫层析法

免疫层析法将免疫法和层析法的优势有效结合，形成了一种更为简便快捷、精准高效的检测技术。免疫层析（ICTSs）探针主要有酶、胶体金、量子点脂质体等。免疫胶体金技术主要原理是使抗原/抗体被载体包被，载体通常以微孔滤膜为主，将包被好的抗原/抗体加入到待测样品中，通过载体的毛细作用，使待测样品中的抗原/抗体与载体中的抗体/抗原结合，再与胶体金标记物结合，从而被聚集在检测带上。向辉等[4]采用抗体与标记的磁性荧光纳米颗粒相结合的免疫层析技术对副溶血性弧菌TDH基因进行检测，特异性较高，浓度范围为1～105 CFU·mL-1，比测定产葡萄球菌肠毒素B的金黄色葡萄球菌试纸条的灵敏度提高了100倍。

2 副溶血性弧菌的分子生物学检测技术

2.1 实时荧光PCR法

实时荧光PCR又称RT-PCR，其原理是通过高溫将模板基因裂解成单链，然后退火，两条引物分别与单链上的一段序列结合，在聚合酶的催化作用下，以单链DNA为模板利用底物合成新的DNA片段，然后再次循环解链、退火延伸，从而达到扩增的目的。底物中加入了荧光基团，仪器通过采集荧光信号实时监测PCR反应系统。闻洁等[5]建立了复合探针实时荧光PCR技术对海产品中副溶血性弧菌tlh基因进行检测。无需增菌状态下，样品含菌量为103 CFU·g-1（或103 CFU·mL-1）时即可检出。增菌6 h时，只需1 CFU·g-1（或1 CFU·mL-1）的副溶血性弧菌即可检出。该方法快速准确灵敏度高，大大缩短检验周期。

2.2 多重PCR法

多重PCR是在同一体系里加入2对以上引物，可同时检测多个目标基因。蒋蔚等[6]采用多重PCR法针对groEL基因特异性扩增VP644bp目标片段，可同时分离霍乱弧菌、创伤弧菌和副溶血性弧菌，检出限可达102 CFU·mL-1。高世光等[7]采用双重荧光PCR法对副溶血性弧菌tdh和trh毒力基因进行检测，最低检出限达到20 CFU·mL-1，100%特异度。Hossain MT等[8]建立的多重PCR可同时对特异性基因（tlh）和毒力基因（tdh和 trh）进行检测，既能检测出副溶血性弧菌的总量又能检测出具有致病性的副溶血性弧菌数量。

2.3 LAMP法

日本學者Notomi T [9]于2000年在Nucleic Acids Res上公开环介导等温扩增技术（LAMP），该方法具有反应时间短，操作简单，灵敏度高，不需要特殊仪器，肉眼即可观察结果等特点，适合基层快速诊断。相兴伟等[10]针对副溶血性弧菌rox R基因和霍乱弧菌omp W基因建立一种双重LAMP法，可同时对副溶血性弧菌和霍乱弧菌进行检测。对60份海鲜样品进行检测，结果显示检出限达到3.12 fg，并且与其他菌株无交叉反应，100%特异性。模拟食品样品检出限达到50 CFU·mL-1。Malcolm TTH等[11]检测海产品时同时采用多重PCR法和LAMP法进行检测，当目标菌含量比较高时两种方法区别不大，当含有痕量目标菌时LAMP比多重PCR灵敏度更高，具有明显优势。

3 MALDI-TOF-MS检测技术

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）是食源性疾病鉴定和检测的新技术。1988年，质谱和裂解技术初次联合应用于细菌鉴定，此后利用质谱技术检测微生物的序幕被逐渐拉开。质谱技术检测食源性致病菌的主要原理是将基质化合物与经过预处理的待测样品按照一定的比例混合，使待测物质均匀分散在基质化合物中。在脉冲激光的激发下基质分子被电离产生大量氢离子，氢离子转移到样品分子中，使其解析或电离，气化后的样品形成带电离子。但在这一过程中，并没有化学键的断裂，只形成了多聚体。通过对多肽离子的采集和分析，得到图谱并与数据库中的标准图谱进行对比，从而鉴定和区分菌种种类。

Ryan T Saffert等[12]用BD公司的Phoenix自动生化鉴定系统和Bruker公司的Biotyper MALDI-TOF-MS系统对440株革兰氏阴性菌进行鉴定。结果表明，自动生化鉴定仪在属水平和种水平上的准确率分别为83%和75%，MALDI-TOF-MS在属水平和种水平上鉴定的准确率分别为93%和82%。MALDI-TOF-MS和自动生化鉴定仪鉴定常见菌株属水平的准确率均能达到95%，对于不常见的菌株可鉴定到属水平，两者准确率分别为85%和52%，有显著差异。由此可见MALDI-TOF-MS对不常见革兰氏阴性菌的鉴定有显著优势。Mcelvania TeKippe E等[13]对239株革兰氏阳性菌采用MALDI-TOF-MS法进行鉴定。其中220株鉴定属水平的准确率达92.1%，181个分离株中167株鉴定到种水平的准确率达92.2%。Bruker公司的MALDI-TOF-MS数据库有2 371个菌株，包含革兰氏阴性菌、兰氏阳性菌、酵母菌、丝状真菌与分枝杆菌革兰氏阳性等。菌株数据库还在不断增加和完善，质谱检测会得到更广泛的应用。

4 展望

传统检测副溶血性弧菌的方法操作繁琐，费时费力，对检测人员要求高，不能满足快速检测的需要。因此，免疫学和分子生物学已经成为快速检测的主流。随着新技术的发展，未来将是各项技术融合优化、联合使用，如免疫磁珠与PCR联用技术、免疫磁珠与LAMP联用技术[14]、液相芯片与多重PCR联用技术等[15]。MALDI-TOF-MS以快速、高通量和未知菌鉴定等特点成为近年发展起来的微生物快速鉴定检测技术，在欧美等发达国家已经发展到较为成熟的阶段，在我国还处于起步阶段。我国已经发布了关于MALDI-TOF-MS检测的国家标准，随着相关研究的进一步深入，MALDI-TOF-MS将会成为未来快速检测中不可或缺的重要手段。

参考文献：

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[13] Mcelvania Tekippe E， Shuey S，Winkler D W，et al. Optimizing identification of clinically relevant gram-positive organisms by use of the bruker biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system[J]. Journal of Clinical Microbiology，2013，51（5）：1421-1427.

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