不同海拔高度青钱柳活性成分及生物活性的比较

王鑫煜，林森洪，张作法*

(1.浙江众博堂生物科技有限公司，浙江 杭州 31000； 2.浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州 310021)

研究发现，自由基能够引起人体内癌症、糖尿病、心血管疾病等多种慢性病的发生，而抗氧化剂可以降低慢性病发生的风险[1]。目前人工合成的抗氧化剂用的比较多，但是这类物质对人体及动物有一定的毒副作用。天然抗氧化活性物质是从动植物中提取的一类具有抗氧化活性物质，具有安全无毒的特点[2]。因此，天然抗氧化活性物质越来越被人们所关注[3]。

糖尿病作为21世纪的流行病，已成为继心脑血管病、癌症之后的第三大疾病，其中2型糖尿病占95%。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制小肠刷状缘上葡萄糖苷酶活性，从而调节控制碳水化合物在肠道的吸收，达到防治餐后高血糖症和缓解高胰岛素血症的目的[4]。目前市售的降血糖药主要有阿卡波糖和伏格列波糖，然而由于这类药物也存在一定的不良反应，因此，从天然植物中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂越来越受到人们的关注。

青钱柳别名：摇钱树、麻柳、清钱李、山麻柳、山化树等。青钱柳是冰川世纪幸存下来的珍稀树种，仅存于中国[5]。青钱柳被誉为植物界的大熊猫，医学界的“第三棵树”。因其特殊的生物活性，被医学界称为“天然植物胰岛素”。研究表明，青钱柳叶中含有大量的生物活性物质，其中包括黄酮类、三萜类和多酚类化合物等次生代谢产物[6]。这些物质在提高青钱柳的抗逆性和协调与环境关系上发挥重要的作用，其合成和积累与初级代谢产物相比更容易受到环境条件影响[7]。本试验中通过比较不同海拔高度的青钱柳叶中活性物质的含量及生物活性，为青钱柳产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

青钱柳叶子于2019年8月底采自浙江众博堂生物科技公司遂昌两个不同海拔的基地(400 m和1 300 m)。将收集的叶片冷冻干燥后，粉碎过0.15 mm孔筛，置于-70 ℃冰箱中备用。

1.2 提取物的制备

取粉碎好的各样品约20 g，加入70%乙醇1 000 mL，超声提取30 min，提取结束后，过滤，残渣再加入70%乙醇1 000 mL超声提取1次，合并滤液，真空旋转蒸发浓缩，进一步冷冻干燥，得提取物。

1.3 活性成分含量测定

多酚含量。根据Singleton等[8]的方法略加改动。不同浓度样品液1 mL，加入0.5 mL的福林酚(10%)试剂摇匀，反应8 min，再加入10%碳酸钠溶液2 mL，摇匀，避光反应60 min，于750 nm处测定吸光度。

总黄酮含量。参考文献[9]。不同浓度的样品液1 mL，分别加入0.3 mL的5%亚硝酸钠溶液，摇匀，振荡反应5 min；再加入0.3 mL的10%硝酸铝溶液，摇匀振荡反应5 min；最后加入1 M的氢氧化钠溶液4.0 mL摇匀，反应10 min。在波长510 nm下测量吸光度。

1.4 抗氧化活性分析

DPPH自由基清除能力。参照Monica等[10]方法并略加改动。取2 mL(不同浓度)样液置于10 mL离心管中，加入2 mL现配的0.1 mmol·L-1的DPPH甲醇溶液，混合均匀后，在室温下反应30 min，于517 nm处测定吸光度。

ABTS清除能力[11]。配制7 mmol·L-1的ABTS+和2.45 mmol·L-1的过硫酸钾溶液，并按照1∶1的比例混合后，避光保存12～16 h。用磷酸缓冲溶液(10 mmol·L-1，pH值7.4)稀释ABTS+储备液，使其在734 nm波长处测定的吸光度值为0.7±0.02。不同浓度的提取物0.5 mL加入稀释后的ABTS+溶液2.0 mL，准确振荡30 s，测定734 nm波长处的吸光度值。

1.5 α-糖苷酶抑制活性试验[12]

以PNPG为底物，阿卡波糖为阳性对照，测定青钱柳提取物的酶抑制活性。向不同浓度的青钱柳提取物中依次加入PBS缓冲液和α-葡萄糖苷酶液，于37 ℃培养箱中反应15 min，加入底物PNPG溶液，于37 ℃水浴20 min，加入0.2 mol·L-1NaCO3溶液终止反应，于405 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 不同海拔对青钱柳提取物中总黄酮和多酚含量的影响

不同海拔的青钱柳经70%乙醇提取。由图1可知，低海拔和高海拔的青钱柳提取物中黄酮类含量分别达到11.86%和14.62%，多酚含量分别达到17.65%和21.50%；高海拔青钱柳黄酮和多酚含量显著高于低海拔青钱柳。

图1 不同海拔对青钱柳乙醇提取物中黄酮和多酚含量的影响

2.2 不同海拔对青钱柳提取物DPPH清除活性的影响

DPPH自由基清除法是一种最常用的抗氧化活性方法。抗氧化剂能够给DPPH自由基提供氢原子和电子使其褪色，吸光值越小，其颜色变得越浅表明抗氧化剂的抗氧化能力越强[13]。由图2可知，各样品的DPPH清除能力与浓度密切相关。在浓度为0.125～2.00 mg·mL-1的浓度范围内，低海拔青钱柳提取物的DPPH清除率为25.2%～79.3%，高海拔青钱柳提取物的清除率为37.5%～94.3%。低高海拔的半抑制浓度分别为0.39和0.19 mg·mL-1。

图2 不同海拔对青钱柳乙醇提取物DPPH自由基清除活性的影响

2.3 不同海拔对青钱柳提取物ABTS清除活性的影响

抗氧化剂会将蓝绿色的ABTS+还原成无色的ABTS，在734 nm处测定吸光度，吸光度变化越大，其清除能力就越强[14]。由图3可知，高低海拔的青钱柳提取物均具有较好的ABTS清除活性。各浓度的不同提取物的还原力均低于阳性对照。在相同浓度下，高海拔青钱柳提取物的ABTS清除活性显著高于低海拔青钱柳。

图3 不同海拔对青钱柳乙醇提取物ABTS自由基清除活性的影响

2.4 不同海拔对青钱柳提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

α-葡萄糖苷酶是治疗2型糖尿病的靶点之一，此类酶能将碳水化合物水解为单糖葡萄糖，是碳水化合物水解的关键酶[15]。而葡萄糖苷酶抑制剂则通过可逆占据葡萄糖苷酶与糖结合位点，抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从而降低多糖降解，延缓肠道对碳水化合物的吸收，达到改善高血糖的效果。

如图4所示，不同海拔的青钱柳提取物具有不错的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但相比阿卡波糖则活性偏低。高海拔青钱柳提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性显著高于低海拔青钱柳提取物。低海拔青钱柳的半抑制浓度为1.36 mg·mL-1，而高海拔青钱柳提取物的糖苷酶半抑制浓度仅为0.49 mg·mL-1，略高于阿卡波糖。

图4 不同海拔对青钱柳乙醇提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

3 小结与讨论

黄酮作为稳定的自由基清除剂是在自然界中普遍存在的一类化合物[16]。多酚被称为“第七类营养素”[17]，是来源于苯丙氨酸代谢途径和莽草酸途径的重要次生代谢物。作为重要的次生代谢物，可减轻人体氧化损伤，预防癌症和心血管疾病[18]。黄酮和多酚的代谢受环境条件的影响，如高光照、高无机碳利用率，低养分利用率等不利的环境条件下，植物生长比植物光合作用更受限制时，更多的碳才可以用于以碳为基础的次生代谢产物的生成[19]。

本研究中，高海拔的环境条件比低海拔更不利于青钱柳的生长，但却在很大程度上提高了青钱柳叶中黄酮和多酚的含量。一些研究已经证明了抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性与多酚和黄酮化合物之间的关系[20]。也有研究发现，气候、土壤、环境因素、收获时间等诸多因素都可能影响植物的抗氧化活性[21]。青钱柳中的总黄酮和多酚含量与其抗氧化活性和糖苷酶抑制活性呈显著正相关。综上所述，不同海拔造成的环境条件可以影响青钱柳次生代谢物的累积，从而造成其抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性的不同。高海拔青钱柳含有更高的黄酮和多酚含量，其抗氧化活性与α-葡萄糖苷酶抑制活性也很高。