基于RNA-seq分析戊型肝炎病毒感染HepG2细胞后的差异表达基因

唐媚娜，何 伟，肖卫红，熊 银，饶亚华，胡志敏

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)是引起戊型肝炎(Hepatitis E,HE)的病原体，经粪-口途径传播。在发展中国家，戊型肝炎是一个重要的公共卫生问题，我国是HEV的流行区。HEV是单股正链RNA病毒，呈球形、直径27～34 nm，无包膜，核衣壳呈二十面体立体对称。基因组长约7.2 kb，3′端有poly A尾，有3个开放阅读读框(Open Reading Frame, ORF)。HE是一种自限性传染病，主要导致隐性感染及急性肝炎，一般不发展为慢性肝炎。戊型肝炎在15～39岁的青年和成人高发，孕妇罹患率高，且病情严重，在妊娠的后3个月发生感染病死率可达20%[1]。有研究表明，它与器官移植患者、免疫抑制患者以及老年人的戊型肝炎慢性化有关[2-3]。

RNA-Seq，即RNA测序，又称转录组测序，是最近发展起来的利用深度测序技术进行转录组分析的技术。通过Illumina高通量测序平台，将RNA反转录为cDNA进行测序，再通过直接比对该基因组区域的reads数来衡量其转录水平。近年来，随着大规模测序技术的不断发展，RNA-Seq技术被广泛应用于各类研究领域，极大地改变了转录组研究的前景[4-5]。与基因芯片相比，RNA-Seq技术可定量研究RNA的表达水平，其结果更为准确，且方便在实验结果间进行直接比较。通过RNA-Seq技术可准确测定特异基因的表达水平、差异剪接和等位基因转录本的特异表达，来说明许多生物相关的问题[6]。目前RNA-Seq技术广泛应用于差异表达基因的筛选，并且可用于健康组织与疾病组织之间基因表达差异的研究[7]。

为了更好地了解感染后发生的即时变化，本研究基于RNA测序 (RNA-Seq)，在基因水平上对HEV感染前后HepG2细胞的差异表达基因进行研究，旨在筛选出与HEV感染相关的候选基因，从而为今后深人研究HEV感染相关的基因及其功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1病毒株与细胞 HepG2细胞株购自上海中科院细胞库。HEV genotype-3 Kernow-C1/p6病毒株来自武汉大学基础医学院医学病毒研究所，滴度约为3×108pfu/mL。

1.2试剂与耗材 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养基、 胎牛血清(Fetal Bovine Serum)及胰蛋白酶 (Trypsin)均购自GIBCO公司(Grand Island, NY, USA)；总RNA提取Trizol Regent购自Thermo公司(Waltham, MA, USA)；反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with cDNA Eraser购自Takara公司(Shiga, Japan)；mRNA纯化试剂盒(Dynabeads mRNA direct Purification Kit)购自Thermo公司；NanoDropND-1000分光光度计购自Thermo公司。

1.3样品获取、处理与测序 感染前，将HepG2细胞均匀种植于48孔板，培养基为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(10% FBS/DMEM)，37 ℃，5% CO2环境下培养。感染组4孔，对照组4孔(约 5×104cells/孔)。当细胞汇合度达到60%～70%后，感染组接种5×103GE(genome equivalents)/细胞的HEV genotype-3 Kernow-C1/p6病毒，对照组用等量4% PEG8000处理；感染4 h后，弃去培养基，以1×PBS洗涤3次后，加入新鲜10% FBS/DMEM 维持培养24 h[1 dpi(day(s)post infection)]后，收取第1批RNA；继续培养48 h(3 dpi)后，收取第2批RNA；继续培养48 h(5 dpi)后，收取第3批RNA；继续培养48 h(7 dpi)后，收取第4批RNA。使用分光光度计检测RNA的OD260/OD280及浓度。将符合纯度及浓度要求的15 μg RNA用干冰保存送测序。

利用第二代高通量测序技术Illumina Hiseq 2000对HEV感染前后(感染前、后各4组)的HepG2细胞RNA进行转录组测序，测序由本实验室自行完成。其中HEV-1、HEV-2、HEV-3、HEV-4为感染组，Mock-1、Mock-2、Mock-3、Mock-4为对照组。具体测序程序包括：提取总RNA并纯化mRNA，将所得到的mRNA随机打断成片段，再用随机引物和逆转录酶合成cDNA片段，再对cDNA片段进行末端修复，并连接测序接头，富集纯化的cDNA模板后用Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer对文库进行质检，最后上机测序。

1.4免疫印迹和免疫荧光检测感染细胞病毒表达 使用 2×SDS Sample buffer 裂解上述感染组及对照组(感染4 h后，弃去培养基，以1×PBS洗涤3次后，加入新鲜10% FBS/DMEM 维持培养24 h)细胞 10 min，超声 5 s×3 次(无需 100 ℃变性)。使用 BCA 蛋白定量试剂盒进行定量，取 20 μg 总蛋白上样(20 μg/孔)。根据分子克隆所示方法制备 8% SDS-PAGE 分离胶，5%堆积胶，以 80 V 恒压电泳。290 mA，转膜 2 h，封闭液(5%脱脂牛奶/PBS)封闭 1 h。5%BSA/PBS 稀释的 Anti-pORF2 antibody 室温孵育 1 h(1∶5 000)。0.1% Triton X-100/PBS 洗膜10 min×2次。5% BSA/PBS 稀释的Anti-IgG-HRP antibody室温孵育1 h。0.1% Triton X-100/PBS 洗膜 10 min×3 次，按 ECL 说明书配制 ECL 液，孵育膜 5 min。暗室中显影，根据发光强弱调节压片时间使条带更清晰。

将细胞种植在加有灭菌圆形盖玻片的 24 孔板中(约 1×105cells/孔)，按1.3中方法感染细胞，用 10% FBS/DMEM 培养于 37 ℃，5% CO2培养箱中。感染4 h后，弃去培养基，以1×PBS洗涤3次后，加入新鲜10% FBS/DMEM维持培养24 h后，吸去培养基，用4%多聚甲醛/蔗糖/PBS固定15 min，PBS洗5 min×2次，0.1% Triton X-100/PBS 透化10 min，PBS洗10 min×2次；5% BSA/PBS封闭30 min；5% BSA/PBS稀释的Anti-pORF2 antibody室温孵育1 h(1∶500)；PBS洗5 min×5次；5% BSA/PBS 封闭20 min；5% BSA/PBS稀释的Anti-IgG-cy2 antibody(1∶400)室温孵育1 h；PBS洗5 min×7次；加入1 μg/mL的DAPI染核2 min；PBS洗5 min×2次；H2O洗1次。在载玻片上滴60%甘油4 μL，将盖玻片从一侧轻轻粘在载玻片上，在荧光显微镜上观察pORF2的表达情况，用激光共聚焦显微镜扫描和照相。

1.5数据处理与分析 用FastQC分析软件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)对RNA-seq中测得的Raw data进行质量控制和过滤，并去除带接头、含有poly-N以及低质量reads形成纯净序列(Clean reads)；将得到的Clean Reads采用STAR软件对RNA-seq数据进行比对(http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/)，mapping至人的参考基因组(GRCh38.p6 assembly of the human reference from NCBI, ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF)，所得的mapped Reads为有效测序量。

1.6差异表达基因筛选及基因功能和通路分析 对mapped reads进行基因表达定量，使用HTSeq (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count)分别对感染组样本和对照组样本进行reads计数。使用DESeq2(http://genomebiology.com)对感染组和对照组进行基因表达量比较，以差异倍数(Fold change)绝对值≥2且Padj<0.05(Padj是P值经过多重校验校正后的值)为标准计算出感染组样本和对照组样本的差异表达基因，并在DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库对差异表达基因进行GO功能富集分析通路富集分析，采用Fisher检验计算每个GO的P值，筛选出差异基因富集的显著性通路(P<0.05)。

2 结 果

2.1质量控制和短序列比对 感染组细胞成功感染HEV genotype-3 Kernow-C1/p6病毒(图1)。

A为HEV感染组和对照组细胞免疫荧光，感染组成功感染病毒；B为感染组细胞感染后，1～7 d内的HEV病毒载量；C为 Western Blot检测细胞内病毒pORF2表达情况。

从质控结果可知，8个样本测序结果均合格，可用于后续生物信息学分析。应用STAR软件对预处理后的reads进行Genome mapping，将所得到的reads与人的参考基因进行比对(表1)。

表1 感染组与对照组测序reads比对

对mapped reads进行基因表达定量，使用HTSeq分别对实验样本和对照样本进行reads计数，制作密度散点图R-I (Ratio-intensity，图2A)，显示HEV感染组和对照组基因表达水平。

2.2差异表达基因筛选 由主成分分析图(Principal Component Analysis，PCA，图2B)可以看出，感染组和对照组在转录水平上具有明显的差异。图2C显示，以FDR<0.1 (FDR是对P-value的校正值)且差异倍数绝对值≥2(Log2FC≥1或Log2FC≤-1)为条件进行筛选，共得到132个差异基因，其中，上调表达基因127个，下调表达基因5个。表2列出了差异倍数排名前10的基因列表。

A为密度散点图，红点表示HEV感染组的整体表达水平，黑点表示对照组的整体表达水平；B为主成分分析图，蓝点表示戊型肝炎感染组，红点表示对照组；C为戊型肝炎病毒感染细胞与对照细胞差异基因表达的火山图

2.3基因GO功能富集分析 如图3A(生物学过程)和3B所示(分子功能)，显示了部分差异表达基因功能富集结果。其中，横轴代表功能显著性水平(Padj)的-Log10P值；纵轴代表Gene Ontology数据库中对应GO的条目名称。由结果可知，在对差异表达基因进行的富集功能分类中，在生物学过程条目中排名前15位的GO分类分别为：病毒防御、I型干扰素信号通路、病毒基因组复制的负调控、抗病毒、IFN-γ介导的信号通路、固有免疫应答、IFN-α应答、I型干扰素产生的负调控作用、IFN-β应答、IFN-γ应答、免疫反应、炎症反应、ISG15蛋白共轭、IFN-α的细胞应答及病毒转录的负调控等；在分子倍数改变代表感染组和对照组基因表达量的差异倍数，校正后P值即该基因是否为差异表达基因的概率，P<0.05表示基因表达差异有统计学意义。

表2 差异倍数排名前10的基因列表

A为差异表达基因功能富集GO分析(生物学过程)结果示意图；B为差异表达基因功能富集GO分析(分子功能)结果示意图；C为通过DAVID 和KEGG数据库获取的差异表达基因的通路富集分析。

功能条目中排名前15位的GO分类分别为：双链RNA结合、解旋酶活性、蛋白结合、NAD+ADP-核糖基转移酶的活性、单链RNA结合、2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性、RNA结合、GTP酶活性、锌离子结合、泛素蛋白转移酶活性、同一蛋白结合、信号转导活性、GTP结合、连接酶活性及受体结合等。

2.4信号通路分析 对差异表达基因通过DAVID及KEGG数据库进行信号通路分析，以更深入地了解该基因的生物学功能。基于DAVID数据库进行通路注释，采用Fisher检验筛选差异基因富集的显著性通路(P<0.05)。如图3C所示，在对差异表达基因进行的富集功能分类中排名前10的信号通路分别为：甲型流感、单纯疱疹感染、麻疹、C型肝炎、RIG-I样受体信号、病毒致癌、乙型肝炎、Toll样受体信号、胞质DNA传感和趋化因子信号转导通路。

3 讨 论

HEV感染会引起机体产生免疫应答，免疫应答是机体的重要防御机制，也是导致宿主细胞损伤继而产生临床症状的关键因素。戊型病毒性肝炎的临床表现从自限性急性病毒性肝炎(AVH)至急性肝功能衰竭(ALF)，病理变化包括免疫细胞浸润和肝细胞坏死、溶解。人类和动物的研究结果均表明，HEV对肝细胞无直接病变作用，肝细胞的损害并非病毒复制所致，而是由宿主免疫反应引起的宿主细胞损伤，病毒诱发的细胞免疫参与了戊型肝炎病毒感染的发病机制[8]。同时临床上观察到戊型肝炎急性期, 患者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs)在受到ORF2抗原刺激时反应增强，CD4+T细胞数量升高，产生干扰素-γ (IFN-γ) 的量明显高于对照，推断CD4+T细胞，可能参与了戊型肝炎急性患者的肝细胞损伤；此外，临床患者在出现转氨酶升高、黄疸等症状时，伴随抗体上升和病毒载量下降等现象，也表明了肝细胞损伤与体液免疫和细胞免疫反应有关[9]。

本实验通过转录组测序技术，对HEV感染前后HepG2细胞的差异表达基因进行分析，共筛选得到差异表达的基因132个，上调表达基因127个，下调表达基因5个。通过差异表达基因筛选、GO功能富集分析以及KEGG通路分析，筛选出几个与抗病毒免疫相关的基因，与对照组相比，在HEV感染组表达显著上调，这些基因可能与HEV感染相关，参与了宿主抗病毒过程，可作为候选基因，作为进一步深入研究的基础。

3.1DDX58和IFIH1 (RIG-I和MDA5) DDX58基因编码一种RNA解旋酶，与许多细胞过程有关，包括RNA结合和RNA二级结构的改变。它参与病毒双链RNA的识别和免疫应答的调节，相关通路为DDX58/IFIH1 (RIG-I/MDA5)诱导的IFN-α和IFN-β通路。IFIH1，是DDX58的旁系同源基因，与DDX58协同作用诱导I型干扰素产生，发挥抗病毒作用。IFIH1和DDX58与中国汉族人群的慢性丙型肝炎发生相关，是RNA病毒感染天然免疫应答的重要启动子，可能在丙型肝炎病毒(HCV)感染结局中起重要作用[10]。结合本文的研究结果，猜测IFIH1和DDX58可能参与HEV感染过程。RIG-I样受体(RLRs)DDX58和IFIH1是天然抗病毒反应的关键因子。一旦识别出病毒RNA，它们与MAVS相互作用，可能诱导产生I型干扰素[11]。DDX58、IFIH1和IFN调节因子1(IRF1)是抗HEV的关键基因，DDX58的基础表达可抑制HEV感染天然配体5′-三磷酸核糖核酸对RIG-I途径的激活可能抑制戊型肝炎病毒的复制，激活DDX58可刺激细胞通过IFN诱导的JAK-STAT级联信号，产生对HEV的天然免疫[12]。

3.2STAT1和STAT2 STAT家族成员被受体相关激酶磷酸化，形成同源或异源二聚体，转位到细胞核，作为转录激活因子发挥作用。 I型干扰素(IFN-α和IFN-β)与细胞表面受体结合后，通过蛋白激酶导致Jak 激酶(Tyk2和JAK1)活化，以及STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化，磷酸化的STATs二聚体化并与IRF-9 形成一个复合体，称为ISGF3转录因子，进入细胞核。ISGF3结合干扰素刺激反应元件(ISRE)，激活干扰素刺激基因的转录(ISG)，促进细胞进入抗病毒状态。

3.3TLR3 戊型肝炎病毒感染诱导细胞免疫应答主要是通过病原体识别受体(PRRs)实现，包括维甲酸诱导基因I(RIG-I)样受体和Toll样受体(TLRs)[13-14]。TLRs在启动固有抗病毒反应中发挥重要作用，识别病毒RNAs后，激活下游级联信号，涉及各种信号分子，如线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、干扰素调节因子3(IRF3)、IRF7和核转录因子κB(NF-κB)[15-16]。TLRs的特异性配体刺激PBMCs，可以诱导I型干扰素的产生[17]。

I型干扰素，主要包括 IFN-α、IFN-β、 IFN-ε、IFN-κ、FN-ω和IFN-ν等[18-19]，是细胞内抗病毒免疫的第一道防线。一旦细胞内发生HEV感染，病毒基因组被病原体识别受体识别，导致细胞内信号级联快速激活。Ⅰ型干扰素的表达诱导一系列干扰素-刺激基因，帮助细胞对付病毒感染。在感染的细胞中，I型干扰素可直接对抗病毒的感染和复制，并激活其他免疫细胞，如自然杀伤细胞，树突状细胞和Kupffer细胞。在此次研究中，IFI6、IFITM1、IFIH1、IFNL1、IRF9、ISG20、IFI35及IFIT1等多种干扰素诱导蛋白、干扰素诱导跨膜蛋白、干扰素λ1、干扰素调节因子及干扰素刺激基因表达上调，说明HEV感染后，这些基因参与了抗病毒免疫。

TLR3是单次跨膜细胞表面受体，它识别与病毒感染有关的核酸RNA，介导有效免疫所需要的细胞因子的产生，是先天免疫与适应性免疫的关键组成部分。通过TRIF/TICAM1，诱导NF-κB的活化和I型干扰素的生产，刺激细胞因子分泌并促进炎症反应。因此，TLR3可能在宿主防御病毒方面发挥作用。

TLR3和IFN-γ在戊型肝炎发病机制中起重要作用。能高水平表达TLR3和IFN-γ的患者能够控制疾病和康复；而TLR3和IFN-γ低表达的患者倾向于发展为ALF[20]，与ALF患者相比，AVH患者的TLR3基因表达、抗炎和促炎细胞因子的含量均较高；IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β在PBMC培养上清液检测中也较高。沉默TLR3后，在PBMC培养上清液中IFN-γ的水平显著降低[20]。在此次研究中，TLR3表达上调，说明HEV感染后，HEV的RNA会被细胞内的模式识别受体中的TLR3识别，激活MyD88-非依赖途径信号通路，激活IRF9，调节炎性细胞因子IFN-α及IFN-β的表达，产生抗病毒作用。

3.4CXCL8(IL-8)和CXCL10 CXCL8基因编码的蛋白CXCL8是一种趋化因子，属CXC趋化因子家族的成员，主要参与炎症反应。炎症反应中，CXCL8招募中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞到炎症部位，发挥抗感染作用。CXCL10是抗菌基因编码的趋化因子，也属CXC家族成员，是受体CXCR3的配体。结合受体CXCR3后，可刺激单核细胞、自然杀伤细胞和T细胞迁移，调控粘附分子的表达。

NF-κB 作为炎症反应的重要转导通路，参与对免疫反应及炎症反应的调控，包括介导机体对病原体入侵的天然免疫及适应性免疫应答，T、B细胞的发育、增殖及炎症反应等生物过程。NF-κB 还可调控CXCL8的表达，在本次研究中，炎性细胞因子CXCL8表达上调，说明HEV感染后，NF-κB通路激活，促进CXCL8表达上调，促进机体免疫相关蛋白合成、生长抑制、树突状细胞及NK细胞活化、CTL细胞分化以及抗体产生，并最终造成感染细胞凋亡。

3.5EIF2AK2(PKR) 该基因编码的蛋白质是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，结合dsRNA后可通过自磷酸化激活，活化后可以磷酸化翻译起始因子(EIF2S1)，使其活化从而抑制蛋白质的合成，在病毒感染的固有免疫反应中起着关键作用。EIF2AK2可选择性调节免疫应答基因的转录[21]，也可通过磷酸化EIF2S1的α亚基，最终导致细胞和病毒蛋白质的合成停止，抑制病毒的复制。作为一个衔接蛋白和/或通过其激酶活性，都可以调节多种信号通路(p38-MAP激酶，NF-kB和胰岛素信号通路)和转录因子(JUN、STAT1、STAT3、IRF1，ATF3)，这些转录因子参与编码促炎性细胞因子和干扰素的基因的表达。

3.6IRF-9 (ISGF3G) I型干扰素与细胞表面受体结合后，通过蛋白激酶作用导致Jak激酶(Tyk2和JAK1)活化，并使STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化。磷酸化的STATs二聚体化与IRF-9形成一个复合体，称为ISGF3转录因子，进入细胞核。ISGF3结合干扰素刺激反应元件(ISRE)，激活干扰素刺激基因的转录，促进细胞进入抗病毒状态，发挥抗病毒效应。此外，IRF-9还可抑制细胞内HEV RNA的复制[22]。与此次研究结果类似，在一项研究中，急性HEV感染患者的细胞中，IRF-9、STAT1、IFNα和TNFα等基因表达增加[23]，这些结果有助于了解HEV感染的潜在炎症过程，后续研究将关注IRF-9 在抗病毒免疫中的作用。

本研究结合mRNA转录组测序和生物信息学方法，研究了HEV感染前后HepG2细胞的差异表达基因，筛选出可能参与抗病毒免疫的基因，为研究HEV感染提供了目标，也为进一步研究HEV感染的防御反应机制和理解宿主反应提供新的见解。

利益冲突：无