从“五脏相关”理论探讨肝脾肾同治法抗大鼠免疫损伤性肝纤维化的机制∗

刘 定 杨沈秋 张 禹△ 潘祥宾 黄秋思

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150001）

肝纤维化是一种可逆的损伤愈合反应，其病理特征是肝星状细胞（HSC）的激活和细胞外基质（ECM）的积累[1]。肝纤维化是慢性肝病进展为肝硬化的必经阶段，目前西医尚缺乏明确临床用药，因此，如何阻止肝纤维化进程具有重要意义。课题前期临床研究[2-3]发现肝脾肾同治法具有抗肝纤维化作用。为进一步明确其对肝纤维化中关键环节HSC活化和ECM降解的影响，本研究通过观察肝纤维化大鼠中核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、金属蛋白酶组织抑制-1（TIMP-1）表达情况探讨肝脾肾同治法抗肝纤维化的分子机制。

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1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠48只，雄性，体质量（200±20）g，由黑龙江中医药大学药物安全评价中心提供，合格证号：SCXK（黑）2014-004，本实验由黑龙江中医药大学伦理委员会批准，编号DXLL2015081001。所有动物自由饮水饮食，正常饲养适应环境7 d后开始实验。

1.2 实验药物

肝脾肾同治法组方：柴胡10 g，白芍15 g，丹参30 g，莪术10 g，鳖甲25 g，黄芪30 g，淫羊藿15 g，白术20 g，茯苓15 g，甘草10 g。药材由安徽晋仁中药饮片有限责任公司提供，符合2015年版《中国药典》相关规定，煎煮前浸泡2 h，鳖甲先煎2 h，再加入其他药材加水煎煮2次，每次30 min，合并水煎液，浓缩至生药含量2.174 g/mL，置4℃冰箱备用。鳖甲煎丸（武汉中联药业，国药准字号：Z42020772），主要成分：鳖甲胶、阿胶、炒蜂房、炒土鳖虫、鼠妇虫、蜣螂、大黄、桃仁、牡丹皮、射干、黄芩、柴胡、干姜、炒白芍、桂枝、葶苈子、石韦、姜厚朴、瞿麦、法半夏、硝石、党参。临用时研末以蒸馏水配制成混悬液，质量浓度为0.233 g/mL。

1.3 试剂与仪器

无菌猪血清由广州鸿泉生物科技有限公司提供，批号20180101；NF-κB p65和α-SMA抗体由Wanleibo公司提供，批号分别为WL01273b和WL0002a；生物素化山羊抗兔IgG由碧云天公司提供，批号：A0277；辣根酶标记链霉亲和素由碧云天公司提供，批号：A0303；大鼠TNF-α酶联免疫分析（ELISA法）试剂盒由上海卧宏公司提供，批号：DZE30635；苏木精、山羊血清由Solarbio公司提供，批号分别为H8070和SL2-10；TRNzol总RNA提取试剂由天根生化科技（北京）有限公司提供，批号：DP405-02。德国莱卡2135型切片机；Proline微量移液器；ELX-800酶标仪；美国moticam3000显微摄影成像系统；DHG-9031A电热恒温箱；OLYMPUSDP73显微镜；Heal Force-NW10LVF超纯水系统；Eppendorf-Centrifuge 5415D离心机；Applied Biosystems-ABI7500荧光定量PCR仪；美国Thermo-902-ULTS超低温冰箱。

1.4 分组与造模

应用SPSS18.0统计软件进行一般数据统计分析。计量资料以（）表示，计数资料比较采用成组设计资料的t检验，等级资料组间比较采用两独立样本Mann-Whitney U秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.5 给药方法

1.6.4 Real Time PCR检测大鼠肝组织TIMP-1 mRNA表达 采用Trizol总RNA提取试剂进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，各样品的目的基因（TIMP-1上游引物：ACAGCTTTCTGCAACTCGGA，TIMP-1下游引物：CAGCGTCGAATCCTTTGAGC）；和内参（ACTIN上游引物：CCTAAGGCCAACCGTGAAAA，ACTIN下游引物：GACCAGAGGCATACAGGGACA）分别进行Realtime PCR反应，每个样本检测3个复孔，数据采用2-ΔΔCT法进行分析。将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。

1.6 标本采集与检测

健康管理传入中国后，国家政策给予了较大程度的支持，使得健康管理有了一定的发展。2016年8月，由中国医药新闻信息协会主办，中国保健协会、中华医学会健康管理学分会等单位支持的中国首届精准健康管理高峰论坛暨精准健康管理分会成立大会在京召开。这次会议的召开标志着我国健康管理已经从经典的健康管理进入了精准健康管理的新高度。[8]精准健康管理是建立在个体基因检测的基础上，结合健康体检尤其是免疫细胞功能检测、健康档案、生活方式、动态监测和大数据分析解读等，对个体和不同人群提供精准健康评估、干预、督导、健康教育管理服务。精准健康管理时代的来临无疑为构建中国特色的健康管理模式提供了新的思路和要求。[9]

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给药结束后大鼠禁食不禁水12 h，然后用4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，解剖取出肝脏，沿肝脏长轴切取约2 mm厚的肝组织放入10%中性甲醛中固定，常规制备肝组织切片，切片厚度约5 μm；另外取大鼠左叶肝组织100 mg液氮速冻，-80℃保存；再取新鲜肝组织约500 mg，按1∶9加入冰生理盐水，制成10%肝匀浆4℃，4 500 r/min离心15 min，取上清液分装，-20℃保存。

1.6.2 免疫组化检测大鼠肝组织NF-κB p65、α-SMA表达 包埋切片脱蜡至水，抗原修复，3%过氧化氢孵育，山羊血清封闭，一抗NF-κB p65、α-SMA孵育湿盒内4℃过夜，二抗湿盒内37℃孵育30 min。辣根酶标记，DAB显色，苏木素复染脱水、透明、封片，400倍镜检观察蛋白表达，利用Image-Pro Plus（IPP）6.0图像处理分析软件分析阳性面积和累计光密度值，结果予以平均光密度（累计光密度值/阳性面积）进行统计分析。

人体正常吞咽功能由双侧大脑多处皮质及皮质下激活，而脑卒中后吞咽障碍患者的相关脑区则存在功能障碍[4] 。经颅直流电刺激法则可释放微弱电流，并通过电极而使脑兴奋，从而能改够变脑中枢的兴奋性，达到改善吞咽障碍的作用。综上可见，针对脑卒中后吞咽功能障碍的患者，在给予常规康复训练的基础上，再联合经颅直流电刺激法进行治疗，效果较好，故值得推广。

开始开药，正常组、模型组给予生理盐水6.7 mL/kg灌胃；肝脾肾同治组给予水煎剂6.7 mL/kg灌胃；鳖甲煎丸组给予鳖甲煎丸混悬液6.7 mL/kg灌胃。各组均每日1次，持续6周。

1.6.1 肝脏病理观察 使用HE染色观察大鼠肝脏病理学改变。Metavir评分系统[5]对肝组织病理分期进行分级。

1.7 统计学处理

将48只SD大鼠随机分为正常组、模型组、肝脾肾同治组、鳖甲煎丸组[4]，每组各12只。实验动物适应性喂养1周后，除正常组外，其余3组使用未灭活的猪血清腹腔注射，固定时间为周二、周五上午9点，每次每只0.5 mL，每周两次，连续注射8周。造模结束模型组随机处死2只大鼠，取肝组织做HE染色，Metavir分期在F2以上证实造模成功[5]。

1.6.3 ELISA法检测大鼠肝组织TNF-α表达 采用大鼠TNF-α酶联免疫分析试剂盒，严格按照说明书流程操作，用空白孔调零，以标准品的浓度为横坐标，调零后的吸光度（A值）为纵坐标，绘制标准曲线，利用标准曲线计算出待测样品浓度。

2 结果

2.1 肝脾肾同治法对肝纤维化大鼠肝脏病理的影响

见图1，表1。与正常组相比较，模型组Metavir分期显著增高（P＜0.01），说明造模成功；与模型组相比较，鳖甲煎丸组和肝脾肾同治组Metavir分期显著降低（P＜0.05），与鳖甲煎丸组相比较，肝脾肾同治组Metavir分期显著降低（P＜0.05）。

图1 各组肝组织病理切片（HE染色，200倍）

表1 各组大鼠Metavir肝脏纤维分期比较（n）

2.2 各组大鼠NF-κB p65、α-SMA蛋白表达比较

见图2～图3，表2。镜下观察以细胞核内和细胞质呈棕褐色改变为NF-κB p65、α-SMA蛋白阳性标记。与正常组比较，模型组NF-κB p65、α-SMA表达显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，肝脾肾同治组、鳖甲煎丸组NF-κB p65、α-SMA均明显降低（P＜0.01）；与鳖甲煎丸组相比较，肝脾肾同治组NF-κB p65、α-SMA水平显著降低（P＜0.05）。

表2 各组大鼠NF-κB p65、α-SMA、TNF-α、TIMP-1 mRNA表达比较（±s）

表2 各组大鼠NF-κB p65、α-SMA、TNF-α、TIMP-1 mRNA表达比较（±s）

与正常组比较，∗P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；与鳖甲煎丸组比较，△P＜0.05

n组别正常组模型组肝脾肾同治组鳖甲煎丸组12 10 12 12 NF-κB p65 0.071±0.006 0.133±0.010*0.085±0.005#△0.095±0.013#α-SMA 0.053±0.007 0.121±0.014*0.087±0.010#△0.098±0.012#TNF-α（ng/L）110.28±11.55 171.57±10.24*125.13±9.63#△134.43±7.81#TIMP-1 mRNA 1.00±0.00 2.31±0.24*1.31±0.17#1.23±0.11#

2.3 各组大鼠TNF-α表达比较

图2 各组NF-κB p65免疫组化（DAB染色，400倍）

图3 各组α-SMA免疫组化（DAB染色，400倍）

见表2。ELISA法检测结果显示，模型组大鼠肝组织TNF-α水平显著高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）。肝脾肾同治组和鳖甲煎丸组TNF-α均显著低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）。肝脾肾同治组TNF-α低于鳖甲煎丸组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠TIMP-1 mRNA表达比较

见表2。模型组与正常组比较，大鼠肝组织中TIMP-1 mRNA的相对表达量显著升高（P＜0.01）。鳖甲煎丸组、肝脾肾同治组与模型组比较，大鼠肝组织中TIMP-1 mRNA的相对表达量均显著降低（P＜0.01）。肝脾肾同治组与鳖甲煎丸组TIMP-1 mRNA的相对表达量相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

⑯车宇彤、相妍:《就地城镇化中的新型农村社区建设——以长春市三个典型村为例》，《劳动保障世界》2017年第5期。

3 讨 论

肝纤维化根据其临床表现可归属于“胁痛”“积聚”等范畴。本病病位在肝，与脾、肾关系密切，病机特点为“虚实夹杂”，其中正虚以肝、脾、肾亏虚为主，邪实以血瘀为要。中医藏象学说认为五脏相关，疾病过程中，很可能反映了三脏甚至多脏系统之间的病理关系[6]。《素问·玉机真脏论》有云“五脏相通，移皆有次。五脏有病，则各传其所胜……肝受气于心，传之于脾，气舍于肾”，说明肝纤维化病位虽然在肝，在疾病进展过程中可传变他脏，同时，其他脏腑功能失调亦可影响本脏，成为本病的病因或加重因素。从肝脾间关系来看，一方面，脾的运化功能有赖于肝气的疏泄，《素问·宝命全形论》曰“土得木而达”。同时，肝的功能也有赖于脾胃滋养，《医学衷中参西录》中记载“肝多脾相助为理之脏也……实脾即所以理肝”。从肝肾间关系来看，肝与肾同居下焦，在五行生克关系上有母子相生关系，即母实则子壮，水涵则木荣。明代李中梓在《医宗必读·乙癸同源论》中明确提出“乙癸同源，肾肝同治”之说。研究发现疏肝健脾、补肾活血法具有一定抗纤维化作用[7-9]。结合“五脏相关”分析，机体内环境的稳态可以看作是脏腑间平衡的微观体现，脏腑之间的平衡协调是机体维持正常生命活动的基础。肝纤维化的发生也可以认为是这种平衡协调、整体统一遭到破坏的结果，因此肝脾肾同治就是旨在调整脏腑之间紊乱的状态，以恢复机体内在环境的平衡。研究发现肌成纤维细胞是纤维化过程中产生ECM的主要效应细胞，而HSC是肝脏肌成纤维细胞的主要细胞来源之一，约占82%～96%[10]。HSC激活后，自分泌和旁分泌大量的TIMP-1，导致ECM的过度沉积[1]。越来越多的证据表明，NF-κB 可促进慢性炎症的进展[11]，NF-κB信号被激活，导致其下游靶基因TNF-α在肝脏损伤过程中异常表达[12]，触发炎症级联反应并进一步诱导受损肝细胞凋亡[13]。NF-κB和TNF-α之间的正反馈循环进一步加重了炎症和肝损伤水平[14]，NF-κB的活化有助于活化的HSC生存[1]，而抑制NF-κB可以促进活化的HSC凋亡[15-16]。

本实验结果表明，肝脾肾同治法能减少肝脏组织NF-κB、TNF-α、α-SMA、TIMP-1 mRNA的表达，提示肝脾肾同治法抗肝纤维化机制可能与减轻肝脏细胞周围的炎症环境，促进活化的HSC凋亡及ECM的降解有关。同时，研究结果发现肝脾肾同治组在Metavir肝纤维化分期，NF-κB、TNF-α、α-SMA表达上具有一定优势，基于中药多靶点药物作用，尚需进一步实验研究明确基于“五脏相关”理论的肝脾肾同治法在调节肝纤维化过程中重要相关分子及细胞平衡上的作用。