脱水穿心莲内酯衍生物的合成与其抗血小板聚集活性*

彭智祥 李雪 黄斌 吴先昊 赵诗云

（江西省中医药研究院 南昌330046）

天然产物穿心莲内酯，又名穿心莲乙素，二萜内酯类化合物，为穿心莲Andrographispaniculata（Burm.f.）Nees 的主要活性成分之一，无臭，味极苦，易溶于丙酮、甲醇、乙醇，几乎不溶于水，在穿心莲叶中含量高达1.84%[1]。穿心莲内酯及其衍生物具有广泛的生物活性，除经典抗炎作用外，还具有增强免疫、抗动脉硬化、抗病毒、抗肿瘤等作用[2～3]。本团队前期研究结果表明，穿心莲内酯衍生物炎琥宁的药效成分脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯钾钠盐具有较佳的抗血小板聚集活性[4～6]。本团队基于脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯结构，在C-17 位引入了活性基团，设计并合成了一系列亲水性较强的新型17-氨基取代-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯衍生物，并测定其抗血小板聚集活性。化学结构见图1。

图1 化合物结构图

1 仪器与材料

1.1 仪器 高分辨质谱仪（Agilent 6210）、核磁共振仪（Varian Enity Inova-400 MHz）、旋转蒸发仪（Heidolph）、数控磁力搅拌器（Heidolph）、AggRam血小板聚集仪（BJF52001）

1.2 试剂 脱水穿心莲内酯（广安宏益生物技术有限公司）、脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯（广安宏益生物技术有限公司）、氯吡格雷（成都德斯特生物技术有限公司）、甲醇、二氯甲烷、氯化钠、亚硫酸钠、硫酸钠、苄胺、氯化铵、4- 氨甲基吡啶、环己胺、N-甲基苄胺、4-氨基-哌啶、环丙胺（以上试剂均为市售分析纯）。

1.3 动物 SD 大鼠，清洁级，180～220 g，雄性（江西中医药大学实验动物中心提供）。

2 合成路线与方法

2.1 合成路线 以脱水穿心莲内酯-3,19- 二琥珀酸半酯作为起始原料，在弱碱性条件下，以间氯过氧苯甲酸（m-CPBA）作为环氧化试剂，制备环氧化中间体化合物4。将环氧化中间体化合物4 与氨基取代化合物NHR1R2在Lewis 酸条件下制备化合物5。其中，R1独立选自氢、烷基中的一种；R2独立选自哌啶基、吡啶基、苄基、环己烷基或环丙烷基中的一种。化学结构见图2。

图2 合成路线

2.2 化合物4 的制备 在反应瓶内投入20 g（0.037 6 mol）化合物3、19.455 g m-CPBA、9.474 g碳酸氢钠（NaHCO3），投料摩尔比1:3:3，再加入60 ml 二氯甲烷，在75 ℃温度下，磁力搅拌6 h。薄层色谱（TLC）监测，待原料反应完全后，浓缩除去溶剂，再加入饱和亚硫酸钠水溶液，继续搅拌30 min 左右，用乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯层，无水硫酸钠干燥，浓缩，得淡黄色粗品19.695 g，转化率95.6%。化合物4 谱图数据如下：1H-NMR（400 MHz,DMSO-d6）：δ=7.16～7.03 (m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13 (s,1H),4.82 (d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57(m,1H),4.39～4.17(m,2H),3.80(s,2H),2.77～2.56(m,7H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.47(d,J=12 Hz,1H),2.34(d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03 (m,1H),1.83 (dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55(m,2H),1.55～1.42(m,2H),1.32(dd,J1=2 Hz,J2=12 Hz,1H),1.22～1.08(m,1H),1.01(s,3H),0.87(s,3H)；13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,147.1,135.5,129.1,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,61.6,60.8,54.8,41.6,38.6,38.2,36.6,29.5,2 9.3,29.1,28.9,24.1,23.7,22.4,15.2 ppm；MS（ESI）：m/z (%)=547.2([M-H]-,100%)；HRMS（ESI）calcd for C28H35O11[M-H]-：547.217 9.found 547.218 7。化学结构见图3。

图3 化合物4 化学结构

2.3 8-羟基-17-苄氨基-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯 （5a） 的制备 在反应瓶内加入20 g（0.036 5 mol）化合物2、7.810 g 苄胺、3.905 g 氯化铵，投料摩尔比1:2:2，再加入60 ml 甲醇-水（7:5）的混合溶剂，在室温条件下，磁力搅拌24 h。TLC 监测，待原料反应完全后，浓缩除去溶剂，再加入饱和氯化钠水溶液，用二氯甲烷萃取3 次，合并二氯甲烷层，加入无水硫酸钠干燥，浓缩，得淡黄色粗品，再用乙醇结晶，得白色固体22.316 g，转化率93.3%。化合物5a 谱图数据如下：1H-NMR （400 MHz,DMSO-d6）：δ=7.33 (dd,J1=2.8 Hz,J2=4.0 Hz,2H),7.26 (d,J=2.8 Hz,1H),7.20 (d,J=4.0 Hz,2H),7.16～7.03(m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13(s,1H),4.82(d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57 (m,1H),4.39～4.17 (m,2H),4.33(s,2H),3.80(s,2H),2.77～2.56(m,7H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.47(d,J=12 Hz,1H),2.34(d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03(m,1H),1.83 (dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55(m,2H),1.55～1.42 (m,2H),1.32 (dd,J1=2 Hz,J2=12 Hz,1H),1.22～1.08 (m,1H),1.01 (s,3H),0.87(s,3H)；13C-NMR（100MHz,DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,147.1,143.3,135.5,129.1,126.9,128.5,126.7,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,61.6,60.8,54.8,45.9,41.6,38.6,38.2,36.6,29.5,29.3,29.1,28.9,24.1,23.7,22.4,15.2 ppm；MS（ESI）：m/z（%）=654.3([M-H]-,100%)；HRMS（ESI）calcd for C35H44NO11[M-H]-：654.299 3.found 654.300 7。化学结构见图4。

图4 8-羟基-17-苄氨基-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯

2.4 8-羟基-17-（4-哌啶甲基-氨基）-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯（5b）的制备 在反应瓶内加入20 g（0.036 5 mol）化合物2、7.889 g 4-氨甲基吡啶、3.905 g 氯化铵，投料摩尔比1:2:2，再加入60 ml 甲醇-水（7:5）的混合溶剂，在室温条件下，磁力搅拌24 h。TLC 监测，待原料反应完全后，浓缩除去溶剂，再加入饱和氯化钠水溶液，用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，浓缩，得淡黄色粗品，再用乙醇结晶，得白色固体22.804 0 g，转化率95.2%。化合物5b 谱图数据如下：1H-NMR（400 MHz, DMSO-d6）：δ=8.45 (d,J=8.0 Hz,2H),7.35(d,J=8.0 Hz,2H),7.16～7.03(m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13(s,1H),4.82(d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57(m,1H),4.39～4.17(m,2H),4.40(s,2H),3.80(s,2H),2.77～2.56(m,7H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.47 (d,J=12 Hz,1H),2.34 (d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03 (m,1H),1.83 (dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55(m,2H),1.55～1.42(m,2H),1.32(dd,J1=2 Hz,J2=12 Hz,1H),1.22～1.08(m,1H),1.01(s,3H),0.87(s,3H)；13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,149.9,147.8,147.1,135.5,129.1,122.4,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,61.6,60.8,54.8,45.8,41.6,38.6,38.2,36.6,29.5,29.3,29.1,28.9,24.1,23.7,22.4,15.2 ppm；MS（ESI）：m/z(%)=655.3([M-H]-,100%)；HRMS（ESI）calcd for C34H43N2O11[M-H]-：655.294 5.found 655.295 2。化学结构见图5。

图5 8-羟基-17-（4-哌啶甲基-氨基）-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯

2.5 8-羟基-17-环己氨基-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯（5c）的制备 在反应瓶内，加入20 g（0.036 5 mol）化合物2、7.235 g 环己胺、3.905 g 氯化铵，投料摩尔比为1:2:2，再加入60 ml 甲醇-水（7:5）的混合溶剂，在室温条件下，磁力搅拌24 h。TLC 监测，待原料反应完全后，浓缩除去溶剂，再加入饱和氯化钠水溶液，用二氯甲烷萃取3 次，合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，浓缩，得淡黄色粗品，再用乙醇结晶，得白色固体22.163 g，转化率93.8%。化合物5c 谱图数据如下：1H-NMR （400 MHz,DMSO-d6）：δ=7.16～7.03 (m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13 (s,1H),4.82 (d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57(m,1H),4.39～4.17(m,2H),3.80(s,2H),2.77～2.56(m,7H),2.57(t,J=3.6 Hz,1H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.42(d,J=12 Hz,1H),2.34(d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03(m,1H),1.83(dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55(m,2H),1.55～1.42(m,4H),1.39 (dt,J1=3.6 Hz,J2=16 Hz,4H),1.32 (dd,J1=2 Hz,J2=12 Hz,1H),1.22～1.08 (m,1H),1.15 (m,4H),1.01(s,3H),0.87 (s,3H)；13C-NMR （100 MHz, DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,147.1,135.5,129.1,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,62.5,61.6,60.8,54.8,41.6,38.6,38.2,36.6,34.0,29.5,29.3,29.1,28.9,25.8,25.2,24.1,23.7,22.4,15.2 ppm；MS （ESI）：m/z (%)=646.3([M-H]-,100% )；HRMS （ESI）calcd for C34H48NO11[M-H]-：646.330 6.found 646.331 8。化学结构见图6。

图6 8-羟基-17-环己氨基-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯

2.6 8-羟基-17-（N-甲基-1-苄基）-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯（5d）的制备 在反应瓶内，加入20 g（0.036 5 mol）化合物2、8.839 g N-甲基苄胺、3.905 g 氯化铵，投料摩尔比为1:2:2，再加入60 ml 甲醇-水（7:5）的混合溶剂，在室温条件下，磁力搅拌24 h。TLC 监测，待原料反应完全后，浓缩除去溶剂，再加入饱和氯化钠水溶液，用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，浓缩，得淡黄色粗品，再用乙醇结晶，得白色固体20.423 g，转化率83.6%。化合物5d 谱图数据如下：1H-NMR（400 MHz,DMSO-d6）：δ=7.34 (dd,J1=4.0 Hz,J2=2.8 Hz,1H),7.27 (d,J=2.8 Hz,1H),7.24 (d,J=4.0 Hz,1H),7.16～7.03(m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13(s,1H),4.82(d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57(m,1H),4.39～4.17(m,2H),3.80(s,2H),3.84(s,2H),3.25(s,3H),2.77～2.56(m,7H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.47(d,J=12 Hz,1H),2.34(d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03 (m,1H),1.83 (dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55(m,2H),1.55～1.42(m,2H),1.32(dd,J1=2 Hz,J2=12 Hz,1H),1.22～1.08 (m,1H),1.01 (s,3H),0.87(s,3H)；13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,147.1,140.2,135.5,129.1,128.5,128.0,127.2,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,61.6,60.8,57.1,54.8,41.6,38.6,38.2,36.6,35.8,29.5,29.3,29.1,28.9,24.1,23.7,22.4,15.2 ppm；MS（ESI）：m/z(%)=668.3([M-H]-,100%)；HRMS（ESI）calcd for C36H46NO11[M-H]-：668.314 9.found 668.316 1。化学结构见图7。

图7 8-羟基-17-（N-甲基-1-苄基）-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯

2.7 8-羟基-17-（4-哌啶-氨基）-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯（5e）的制备 在反应瓶内加入20 g（0.036 5 mol）化合物2、7.307 g 4- 氨基- 哌啶、3.905 g 氯化铵，投料摩尔比为1:2:2，再加入60 ml 甲醇-水（7:5）的混合溶剂，在室温条件下，磁力搅拌24 h。TLC 监测，待原料反应完全后，浓缩除去溶剂，再加入饱和氯化钠水溶液，用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，浓缩，得淡黄色粗品，再用乙醇结晶，得白色固体21.487 g，转化率90.8%。化合物5e 谱图数据如下：1H-NMR（400 MHz,DMSO-d6）：δ=7.16～7.03(m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13(s,1H),4.82(d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57(m,1H),4.39～4.17(m,2H),3.80(s,2H),2.77～2.56(m,12H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.47 (d,J=12 Hz,1H),2.34 (d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03 (m,1H),1.83 (dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55 (m,6H),1.55～1.42 (m,2H),1.32(dd,J1=2 Hz,J2=12Hz,1H),1.22～1.08(m,1H),1.01(s,3H),0.87(s,3H)；13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,147.1,135.5,129.1,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,61.6,61.2,60.8,54.8,43.5,41.6,38.6,38.2,36.6,32.6,29.5,29.3,29.1,28.9,24.1,23.7,22.4,15.2 ppm；MS（ESI）：m/z(% )=647.3 ([M-H]-,100% )；HRMS （ESI）calcd for C28H47N2O11[M-H]-：647.325 8.found 647.327 3。化学结构见图8。

图8 8-羟基-17-（4-哌啶-氨基）-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯

2.8 8-羟基-17-环丙氨基-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯（5f） 的制备 在反应瓶内加入20 g（0.036 5 mol）化合物2、4.165 g 环丙胺、3.905 g 氯化铵，投料摩尔比为1:2:2，再加入60 ml 甲醇-水（7:5）的混合溶剂，在室温条件下，磁力搅拌24 h。TLC 监测，待原料反应完全后，浓缩除去溶剂，再加入饱和氯化钠水溶液，用二氯甲烷萃取3 次，合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，浓缩，得淡黄色粗品，再用乙醇结晶，得白色固体21.209 g，转化率96.0%。化合物5f 谱图数据如下：1H-NMR （400 MHz,DMSO-d6）：δ=7.16～7.03 (m,1H),6.95～6.86(m,1H),6.13 (s,1H),4.82 (d,J=1.2 Hz,2H),4.67～4.57(m,1H),4.39～4.17(m,2H),3.80(s,2H),2.77～2.56(m,7H),2.48(d,J=2 Hz,1H),2.47(d,J=12 Hz,1H),2.34(d,J=10 Hz,1H),2.05～2.03 (m,1H),1.83 (dd,J1=1.2 Hz,J2=10 Hz,1H),1.67～1.55 (m,2H),1.55～1.42 (m,2H),1.32 (m,2H),1.22～1.08(m,1H),1.01(s,3H),0.87(s,3H),0.56(m,4H)；13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）：δ=177.1,173.6,172.6,172.6,171.9,147.1,135.5,129.1,121.4,80.4,69.7,64.9,63.8,61.6,60.8,54.8,41.6,38.6,38.2,36.6,30.9,29.5,29.3,29.1,28.9,24.1,23.7,22.4,15.2,8.1 ppm；MS（ESI）：m/z(%)=604.3 ([M-H]-,100% )；HRMS （ESI）calcd for C31H42NO11[M-H]-：604.283 6.found 604.285 0。化学结构见图9。

图9 8-羟基-17-环丙氨基-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯

3 抗血小板聚集活性测试

选用健康雄性SD 大鼠，随机分组，以氯吡格雷作为对照组，生理盐水作为空白对照组，化合物5a、5b、5c、5d、5e、5f 作为给药组，连续7 d 灌胃给药，第6 天禁食过夜，第7 天给药2 h 后用水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，腹主动脉取血流入含有3.8%枸橼酸钠溶液（1：9）的离心管中，以转速1 000 r/min 离心10 min 取上清液既得富血小板血浆（PRP），剩余部分以3 000 r/min 离心10 min，取上清液既得贫血小板血浆（PPP），加入二磷酸腺苷（终浓度为1.5 μmol/L）诱导聚集，在37℃下，测定5 min 内血小板最大聚集率（PAGmax），限2 h 内完成，并计算给药组血小板聚集的最大抑制率（IR），IR=（正常对照组PAGmax － 给药组 PAGmax）/ 正常对照组PAGmax×100%。见表1。

表1 各组血小板最大聚集率和血小板最大抑制率比较(%)

4 讨论

本研究以脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯为起始原料，设计合成了一系列亲水性较强的新型17-氨基取代-脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯衍生物，并通过Born 氏比浊法测试抗血小板聚集活性。该类衍生物的制备方法简便易行，成本较低，并具有一定抗血小板聚集作用。合成的部分新型17-氨基取代-脱水穿心莲内酯衍生物抗血小板聚集效果优于氯吡格雷，值得进一步研究，有望成为新型抗血小板聚集药物。