杂交小麦种子发芽不同时期内源激素的变化与种子活力的关系

(河南科技学院， 河南 新乡 453003)

种子是作物生产的基本材料，种子质量是影响作物产量的关键因素[1-3]。种子活力是反映种子质量的重要指标，大田生产中，高活力种子能够快速均匀出苗且苗齐苗壮，为高产奠定基础。低活力种子出苗速度慢且苗不齐，易造成减产[4,5]。

种子活力受外部和内部因素双重影响，其中内源激素能影响多种信号途径调控种子内部的生理变化，是影响种子萌发及种子活力的关键因素。赤霉素(GA3)能够打破休眠，提高种子内源生长素(IAA)含量，进而诱导降解乳糖、葡萄糖纤维素二糖等催化酶活性升高，加快糖的分解，促进胚的分化，进而促进种胚萌发和发芽，而脱落酸(ABA)能够抑制与贮藏物质代谢有关的酶活性，从而限制种子萌发，负向调控种子活力[6-9]。低浓度IAA促进种子萌发，提高种子活力，高浓度则抑制萌发，且不同植物种子对IAA浓度的敏感性不同[10,11]。细胞分裂素(CTKS)对ABA具有拮抗作用，可以解除ABA对种子萌发的抑制[12]。冯燕菇等研究表明，3个高活力小麦种子GA3/ABA的比值均显著高于3个低活力品种，认为GA3含量和GA3/ABA比值是影响种子萌发的重要因素[13]。王永飞等研究表明，在高温条件下，ABA低于正常水平，而细胞分裂素则超过正常水平，在这种情况下，抑制剂/细胞分裂素比值将达到解除休眠的有效水平从而打破休眠，加速种子萌发，提高发芽指数[14]。因此，在种子萌发过程中，激素发挥重要作用，对种子萌发和发芽过程中的激素变化进行深入研究，了解种子发芽过程中不同时期激素含量的变化将为种子活力的解析提供帮助。

小麦是我国第三大粮食作物，2017年全国小麦种植面积约为0.24亿hm2，杂交小麦较普通小麦具有较高的增产潜力，其种子活力强弱直接关系到用种量及最终产量，激素是影响种子活力的关键因素，对其种子发芽过程中的激素变化进行深入研究，有助于理解激素在杂交小麦种子活力及幼苗发育中的调控作用，为杂交小麦推广提供帮助。本研究以河南科技学院新选育的2个杂交小麦和2个普通小麦种子为研究对象，检测了发芽72 h内源激素水平，考察了4个品种的种子活力，为揭示种子发芽不同阶段内源激素水平与种子活力的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为百农矮抗58、周麦18、杂交小麦BN 666(BNS 366/0567)、杂交小麦665(BNS 366/矮05)，由河南科技学院小麦中心提供。

1.2 方 法

1.2.1激素测定

1) 仪器与试剂。

Agilent Technologies 1290 Infiniity Ⅱ高效液相色谱仪，Agilent 1290系列泵，Agilent 1260可变波长检测器，安捷伦液相色谱工作站，Cary 100紫外分光光度计，JA 2003型电子天平(上海市安亭电子仪器厂)，KQ 3200 E型超声波清洗仪(昆山市超声仪器厂)，MIKRO 220 R低温冷冻离心机，智能光照培养箱GTOP-1000 B(浙江托普仪器有限公司)。

生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、细胞分裂素(KT)、玉米素(ZT)标准品(Sigma公司，纯度≥99%)，甲醇(色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司)，80%甲醇(色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司)，45%甲醇(色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司)，乙腈(色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司)，蒸馏水(发芽用)，实验用水为超纯水，所有试剂在使用前均使用0.45 μm微孔滤膜过滤。

2) 色谱条件。

Agilent C 18 ZORBAX反相色谱柱(150 mm×4，6 mm，5 μm，Agilent公司);采用切换波长法;以外标法进行定量测定。流动相A为甲醇，B为0.075%乙酸的水溶液，流速:0.5 mL·min-1;进样量：20 μL。检测器波长设置为254 nm；柱温35 ℃。

3) 样品前处理。

样品处理参照Chen等[15]、Cai等[16]的方法，并予以改进和优化。取适量种子于发芽盒中，设置3个重复，人工培养箱中20 ℃培养。分别于6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取样，置于研钵中加液氮研磨成粉，精确称取4 g，加入预冷的80%甲醇10 mL，放入4 ℃冰箱浸提18 h。将样品在4 ℃条件下，6 000 r·min-1，离心10 min，取上清液置于50 mL离心管中。在残渣中加入8 mL预冷的80%甲醇，继续浸提10 min之后，离心10 min，然后将2次上清液混合。用4 mL乙腈预冲洗C 18小柱(活化小柱)，加4 mL超纯水中和小柱，将上清液过C 18小柱，之后加1 mL超纯水冲洗，加2 mL 45%甲醇进行洗脱。取1 mL洗脱液过0.45 μm滤膜，上机检测。

4)标准曲线绘制。

参照王萌等[17]标准液配制方法，将GA3、ABA、IAA、KT、ZT分别稀释，并配制成GA371.4 μg·mL-1、ABA 2.24 μg·mL-1、IAA 4.40 μg·mL-1、KT 24.4 μg·mL-1、ZT 4.24 μg·mL-1的标准溶液，精确吸取标准液1、2、5、10 μL依次进样，测量其峰面积，以进样量X为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，经线性回归，5种激素标准曲线方程、相关系数列于表1，5种激素在相应的范围内线性关系良好。

1.2.2发芽实验

根据张自阳等[18]的方法进行标准发芽实验，每个品种100粒种子，3个重复，20 ℃人工气候箱进行培养，每天记载发芽种子数，第4天统计发芽势，第7天统计发芽率，发芽结束统计正常幼苗鲜重并计算发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数。

表1 5种内源激素的线性回归方程

发芽势(%)=(第4天发芽种子数/检测种子总数)×100%；

发芽率(%)=(第7天发芽种子数/检测种子总数)×100%；

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)；

活力指数(VI)=GI×S；

式中：Gt为当天的发芽数，Dt为当日天数，S为发芽结束时单株幼苗鲜重。

2 结果与分析

2.1 不同品种种子活力分析

发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数是反映种子活力的重要指标，均与种子活力呈正相关关系。结果表明，杂交小麦发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均显著低于普通小麦，其中BZ 666和BZ 665发芽势和发芽指数差异极显著，发芽率和活力指数差异不显著，百农矮抗58和周麦18间，4个指标差异不显著。综合来看，周麦18发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数最高，而BZ 666的4个指标均最低(表2)，说明4个品种间，周麦18活力最高，BZ 666活力最低。

表2 不同品种种子活力比较

2.2 发芽不同时期4种激素变化趋势分析

为了分析种子发芽期间不同阶段的内源激素变化情况，检测了种子发芽6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的内源GA3、ZT、KT、IAA和ABA含量。从检测情况看，GA3、ZT、KT在6～72 h内均能检测到，生长素仅在48～72 h能够检测到，而ABA则仅在个别品种的某一阶段检测到。除百农矮抗58外，另外3个品种发芽6～48 h内，GA3(图1 A)、KT(图1 B)和ZT(图1 C)变化趋势平稳，48 h后呈上升趋势，但KT的上升速度高于GA3和ZT(图1 B)。萌发48 h后，4个品种IAA含量均上升。按杂交小麦和普通小麦分类，4种激素在种子发芽6～72 h内，普通小麦ZT和IAA含量高于杂交小麦(图1 C、D)，但48 h后，杂交小麦种子KT含量和上升速度高于普通小麦(图1 B)。从单个品种看，普通小麦百农矮抗58种子萌发后4种内源激素的变化趋势不同于其他3个品种，百农矮抗58种子萌发后， 6～24 h内GA3和ZT含量略下降，但24 h后含量上升(图1 A、C)，48 h后，IAA含量上升速度较快(图1 D)，而KT在6～72 h内含量变化平稳(图1 B)。

表3 杂交小麦和普通小麦激素含量差异方差分析

2.3 4个品种不同时期激素含量的方差分析

由表3可知，每个时期的KT和IAA含量差异均显著，尤其是BZ 665与百农矮抗58间，差异均达极显著水平；杂交小麦与百农矮抗58间，每个时期ZT含量均达显著或极显著水平，但杂交小麦与周麦18间仅个别时期差异显著；24～72 h，杂交小麦与百农矮抗58间，GA3含量差异均达极显著，而杂交小麦与周麦18间仅个别时期差异显著。杂交小麦间以及普通小麦间，个别时期的4种激素含量差异也达显著或极显著差异。

2.4 不同时期内源激素与种子活力的相关性分析

由表4可知，发芽24 h、48 h的GA3含量与发芽势、发芽指数、活力指数显著相关；发芽6～72 h的ZT含量与发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数显著或极显著相关；发芽48～72 h的IAA与发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数显著或极显著相关；发芽72 h的KT与发芽势、发芽率、活力指数显著负相关，而6～48 h的与相关指标未检测到相关关系。

表4 不同时期内源激素与种子活力的相关性分析

3 讨 论

种子活力是小麦高产、稳产的重要基础。与普通小麦相比，杂交小麦具有较强的生长优势，主要表现在植株高大，穗多粒多，千粒重高[19]，但杂交小麦与普通小麦种子活力孰优孰劣尚缺乏系统性研究。张自阳等[20]认为，在老化程度一样的情况下，杂交小麦种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数均高于其它4个常规品种，说明杂交小麦的抗老化能力较强。本研究中杂交小麦发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均显著低于普通小麦，这与张自阳等[19]研究结果不一致，可能与实验所用杂交小麦组合来源不同有关。杂交小麦千粒重较高，但灌浆不充分可能也是影响其种子活力的一个因素。

激素是影响种子活力的重要因素[21,22]。GA3、IAA及细胞分裂素对种子活力具有正调控作用，而脱落酸则负调控种子活力。本研究中，发芽24～48 h的GA3、6～72 h的ZT、48～72 h的IAA均与发芽势、发芽指数及活力指数显著或极显著相关，与前人研究结果一致[13,-14]，但发芽6～12 h的GA3含量以及6～48 h的KT含量与种子活力没有相关性，表明发芽不同时期的GA3素和KT对种子活力的影响程度不同。KT是一种细胞分裂素，发芽后72 h其含量与发芽势、发芽指数、活力指数显著负相关，说明不同的细胞分裂素对种子活力的调控作用有差异。发芽48 h后，杂交小麦种子KT含量及上升速度均高于普通小麦，而杂交小麦种子活力低于普通小麦，提示KT可能负向调控种子活力。

本研究对杂交小麦和普通小麦种子活力及发芽不同时期的GA3、KT、ZT、IAA进行研究，发现种子发芽不同时期，激素与种子活力的相关性差异较大。激动素与种子活力各指标负相关，且在杂交小麦中增加较快，提示其可能是杂交小麦种子活力低的一个因素，研究结果为理解种子发芽期的激素生理基础及杂交小麦种子活力遗传改良提供了可能。种子活力的维持是一个复杂的生理生化过程，只有从激素调控、核酸修复、代谢水平和环境影响等各方面进行综合系统的研究，才能真正回答种子活力的本质。杂交小麦由于杂种优势的存在，其种子活力的生理基础更复杂，对其机制进行深入的研究对农业和粮食安全具有重要的意义。