吉林省栽培药材白芍和赤芍种子鉴别

王佳雪 王 冠 李召霞 方春秋 张 涛

(1.长春中医药大学药学院， 长春 130117； 2.吉林省长白山中药资源工程研究中心， 长春 130117)

赤芍是著名的野生道地中药材，用量大、用途广，应用历史久远。吉林省的野生资源在逐年递减，优质的赤芍资源也在递减，药材市场供应难以得到保障，赤芍的市场年需求量大约为4 500 t，货源紧缺。白芍是常用家种大宗药材[1]，年需求量在2 000 t左右。扩大白芍、赤芍资源的人工栽培代替野生挖掘可缓解目前市场上白芍、赤芍短缺的现状，保护中药材资源和生态资源[2]，同时对促进经济发展具有重大意义。

近年来，吉林省白芍和赤芍药材栽培发展迅速，有伊通、蛟河、松原、通化、舒兰、柳河等多处药材种植基地，而在吉林省药材市场，赤芍种子品种复杂，白芍和赤芍种子药农难以分辨，流通过程中造成用药混乱。根据吉林省药材市场情况，现急需鉴别白芍和赤芍种子完整而准确的方法。本研究利用形态特点和分子鉴定等方法研究白芍、赤芍种子鉴别方法，即是利用ITS 2序列对白芍、赤芍种子进行DNA条形码鉴别研究，以ITS 2序列为核心条形码，作为药用植物鉴定的分子依据[3-5]，为吉林省白芍和赤芍药材种植提供科学鉴定依据。白芍来源于毛茛科植物芍药(PaeonialactifloraPall.)的干燥根，赤芍来源于毛茛科植物芍药(P.lactifloraPalI)或川赤芍(P.veitchiiLynch)的干燥根[6]。白芍长于养血调经、敛阴止汗、平抑肝阳[7]；赤芍则长于清热凉血、活血散瘀、清泻肝火[8-9]，二者具有较大的差异。探索研究白芍、赤芍药材的共性与差异，是确保白芍、赤芍质量的关键，为中药材质量标准的建立和实施提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

白芍和赤芍种子采集于吉林省中药材种植基地，白芍种子样本9份，赤芍种子样本9份，从GenBank数据库中下载ITS 2序列：芍药10份，川赤芍、草芍药各4份，新疆芍药2份，窄叶芍药1份(表1)。

1.2 方 法

1.2.1鉴 别

根据《中国植物志》和《中国药典》对所采集植物及其药用部位进行形态学鉴定和药材性状鉴别。

1.2.2药材前处理

剪掉白芍、赤芍植株，分别将含种子的白芍壳、赤芍壳置于自封袋中，放置适量硅胶干燥，直至壳内的白芍、赤芍种子全部裂开，将所有的白芍、赤芍种子放入袋中，放置于通风、干燥处。

表1 白芍、赤芍及芍药属样本来源及ITS 2序列GenBank登录号

1.2.3DNA提取

白芍、赤芍基因组 DNA 提取采用改良的 CTAB法[10]提取DNA，NanoDrop估测浓度，琼脂糖凝胶电泳质量鉴定。

1.2.4PCR扩增及测序

实验样品扩增正向引物5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向引物为5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。 PCR反应体系为20 μL，体系内含PremixTaq10 μL、ddH2O 8 μL、FP(10 μM)0.5 μL、RP(10 μM)0.5 μL、DNA模板(100 ng·L-1)1 μL。ITS 2引物：每个模板做2个PCR管，离心混匀后，加入10 μL石蜡油密封，继续离心，混匀体系后，进行PCR扩增反应。PCR扩增反应步骤为95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40 cycles；72 ℃ 5 min；40 ℃保存。PCR扩增产物经纯化后，进行双向测序，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.5数据处理

测序所得到的序列峰图，运用SeqMan软件去除引物、序列拼接，标准为碱基量不能低于20。对于所获得ITS 2序列，可以使用隐马尔可夫模型(HMMer)的注释方法切除ITS 2两端的5.85和28 S区域.获得标准的ITS 2间隔区序列[11]。采用MEGA 7.0软件对数据进行多序列比对，计算物种(K 2 P)遗传距离并构建NJ系统发育树，进行研究分析。使用Bootstrap(1 000次重复)检验各分支的支持率，仅显示支持率≥50%的数值，来鉴定各样本。

2 结果与分析

2.1 基于样本形态特征、ITS 2序列的物种鉴定分析

通过形态观察显示，白芍、赤芍种子样本二者的形态相似，大小有微小差异，肉眼难以辨别，并且有一定难度，易出现偏差(图1)。

总计18个白芍、赤芍种子样本，ITS 2序列PCR扩增琼脂糖凝胶电泳总DNA提取成功率为100%；ITS 2序列扩增成功率为100%；测序成功率100%。由测序所得峰图分析可知，各个序列的碱基质量均>20，通过BLAST鉴定9份白芍样本和9份赤芍样本碱基序列均确定为芍药(P.lactifloraPall)。

2.2 种内和种间差异

白芍、赤芍种子及芍药属的39个样本的ITS 2序列长度为230 bp。以赤芍样本为基准，运用MEGA 7.0软件进行序列比对，39份样本中共有54个碱基变异位点，经MEGA 7.0分析显示，吉林省中药材种植基地种植的白芍、赤芍种子样本之间没有种内变异位点，区分不出差异(表2)，白芍种子和赤芍种子的遗传距离为0，说明白芍种子与赤芍种子样本无差异(表3)，与从GenBank上下载的芍药有3个变异位点，从GenBank上下载的新疆芍药有7个变异位点，遗传距离为0.04和0.03，从GenBank上下载的窄叶芍药有6个变异位点，遗传距离为0.04、0.03和0.02，从GenBank上下载的草芍药有6个变异位点，遗传距离为0.04、0.03、0.02和0.01，种间变异明显，易于区分。

图1 白芍、赤芍种子的形态特征

表2 基于ITS 2序列白芍、赤芍种子及芍药属的碱基变异

2.3 NJ树聚类分析

根据ITS 2序列，对39个样本构建NJ系统发育树，如图2，除去9个白芍种子样本、9个赤芍种子样本以及GenBanK下载的芍药聚在一支，其他芍药属各为一支，其中从GenBank上下载的川赤芍聚为一支，从GenBank上下载的新疆芍药聚为一支，从GenBank上下载的草芍药聚为一支，同时从GenBank上下载的川赤芍、从GenBank上下载的窄叶芍药与新疆芍药聚为一支。由此可以明显的区分出芍药属不同种虽然在一定程度上有亲缘关系，但仍然存在差别；同时结合变异位点以及(K 2 P)遗传距离可以清晰地发现本实验采集样本白芍、赤芍种子应用ITS 2碱基序列难以区分，种内之间无差异，由此可得出白芍、赤芍种子2个研究样本之间的亲缘关系无差异，结合基于ITS 2碱基序列变异位点、K 2 P遗传距离比较、NJ聚类树显示可得出，说明吉林省中药材种植基地种植的白芍种子和赤芍种子是同种。

表3 基于ITS 2序列白芍、赤芍种子及芍药属样本的K 2 P遗传距离

图2 基于ITS 2序列构建的白芍、赤芍及芍药属的邻接(NJ)树

采用DNA条形码鉴定技术，通过ITS 2条形码片段的比对表明白芍和赤芍种子样本基因序列相同，说明吉林省中药材种植基地的白芍种子和赤芍种子是同种。运用DNA条形码鉴定技术来鉴别种子的真伪，从而实现中药鉴定标准化、自动化。分子生物学方法，即通过基因组进行研究，比较DNA序列上的差异[12]，不受样本形态的限制，减少了人为因素的影响，使得鉴定结果具有准确性。理想的DNA条形码要有足够的种间变异和较小的种内差异。

这一技术的应用对于中药材产业的发展具有重要意义，将其作为一种监察手段，可为中药材种质优选、良种培育、规模化种植等各阶段提供保障;为中药材的种植、加工、流通、临床使用等各个环节提供保障;可维护药农切身利益，减少因假种劣种流通造成的损失;可为中药材质量标准的建立提供一定的参考依据，推进中药材种子质量标准制定实施。