林烟草(Nicotiana sylvestris)K+通道蛋白基因NsAKT 1克隆及生物信息学分析

(贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/生命科学学院， 贵阳 550025)

钾是植物生长发育所必需的大量元素，不仅可参与植物细胞渗透势调节，还能介导植物体中多种重要的生理功能[1]，如K可作为植物细胞内多种酶的催化剂，调控气孔开闭、控制生物大分子合成分解、调节光合作用强弱、影响植物对逆境胁迫能力抗性的高低等[2,3]。另外，钾含量的高低同样决定着农作物的产量与品质，在烟草中K被认为是评判烟叶品质优劣的重要标准之一[4]。植物在长期进化过程中形成了一系列复杂的K+吸收和转运系统。如拟南芥(Arabidopsisthaliana)中存在15个K+选择性通道，包括9个Shaker型、5个TPK(two-pore K+channel)型和1个Kir-like型K+通道[5-7]。AKT 1属Shaker型K+通道，是植物中广泛存在的一种内向整流K+通道[8]。Sentenac等利用酵母双突变体互补法从A.thaliana中克隆出第一个高等植物的Shaker型K+通道基因AtAKT1，该基因位于拟南芥第2号染色体上，含有11个外显子和10个内含子，编码857个氨基酸(amino acid，AA)残基组成的多肽。之后，研究者先后从马铃薯(Solanum tuberosum)[9]、玉米(Zeamays)[10]、小麦(Triticumaestivum)[11]、大麦(Hordeumvulgare)[12]、葡萄(Vitisvinifera)[13]和盐地碱蓬(Suaedasalsa)[14]等植物中分离出AKT1基因。对植物AKT 1编码蛋白结构预测结果表明，AKT 1蛋白含有6个跨膜片段(S1～S6)，其中第4个跨膜片段S4含有大量带正电荷的AA残基，主要作为电压感受器参与响应膜电势的变化，调节其在膜上移动改变AKT 1的构象，实现该通道孔的开启与关闭[15,16]。S5和S6之间含有1个高度保守的P环结构域，陷入细胞膜内构成一个通道孔(图1)。

图1 植物Shaker型K+通道拓扑结构示意图

同时，AKT 1具有Shaker型K+通道中典型的TxGYG(Thr-XGly-Tyr-Gly)序列，该结构为K+选择器。AKT 1胞质端(C端)从第6个跨膜片段末尾起，含有1个C接头(约80个AA残基)，1个环核苷酸结合域(cyclic-nucleotide binding domain，CNBD)，1个锚蛋白域(anchor protein domain，APD)和1个富含疏水性、酸性残基的KHA域[16]。在大多数Shaker型K+通道家族成员中，APD可促进通道与细胞骨架连接、蛋白质相互和胞质的调节等[17,18]。此外，AKT 1在植物逆境胁迫响应中也发挥了重要作用，如介导植物的K+饥饿耐受性[19]、耐盐性[20]及抗旱性等。因此，为了解烟草中AKT1基因的结构和功能，本研究以林烟草(N.sylvestris)为材料，利用同源克隆技术克隆NsAKT1、分析该基因的结构特征；同时，对NsAKT 1蛋白结构进行预测，为进一步研究AKT1在N.sylvestris中的功能和作用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

林烟草(N.sylvestris)植株、大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态菌株DH 5 α均由贵州大学农业生物工程研究院保存并提供。选取生长良好、萌发至6～8叶期的林烟草幼苗为实验材料。克隆载体pGEM-T Easy Vector Systems购于Promega公司；胶回收试剂盒购自Invitrogen Ambion公司；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase，DNA 5000 bp Marker，T4DNA ligase和DNA 2000 bp Marker购于Takara公司；Plant RNA Kit购于Bio-Tek OMEGA公司，MultiScribeTMReverse Transcriptase Kit均购自Applied Biosystems 公司；GelRedTM10000×购于BIOTIUM公司；X-Gal、IPTG、氨苄青霉素(ampicillin，AMP)均购于Sigma-Aldich公司。NsAKT1克隆引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1烟草cDNA制备及NsAKT1克隆

以6～8叶期林烟草幼嫩叶片为材料，参照Plant RNA Kit操作说明提取烟草的总RNA，并反转录为cDNA。RT-PCR反应体系(20.0 μL)：25×dNTP Mix(100 mmol·L-1)0.8 μL，10×RT Buffer 2.0 μL，10×RT Random Primers 2.0 μL，RNA inhibitor 1.0 μL，MultiScribeTMReverse Transcriptase 1.0 μL，Nucleasefree H2O 3.2 μL，RNA template 10.0 μL。反应条件：25 ℃ 10 min；37 ℃ 120 min；85 ℃ 5 min；4 ℃保持。以cDNA为模板，以特异性引物AKT 1-F(5′-ATGGGAGATGTGAGAAGAAATAATAATTTTGG-3′)和AKT 1-R(5′- TCACCTCAACTCATCACCTTCTGATG-3′)，PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳分离检测，比较不同处理及对照样品中条带亮度的相对强弱。

图3 烟草AKT 1蛋白信号肽预测

1.2.2目标片段连接及测序

参照胶回收试剂盒说明，将PCR扩增的亮条带切割后回收DNA，回收的DNA片段参照Promega公司pGEM-T Easy Vector Systems试剂盒操作将此DNA片段通过T4DNA连入T载体后，导入E.coli感受态菌株DH 5 α，通过蓝白斑筛选阳性克隆菌落，菌落送由深圳华大基因科技有限公司进行测序。

1.2.3生物信息学分析

利用DNAMAN对蛋白质氨基酸序列进行分析；ProtParam对蛋白质理化性质预测；利用ProtScale(http://web.expasy.org/ProScale)对蛋白质疏水性进行分析；SignalP 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)进行信号肽预测；TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)进行蛋白跨膜螺旋分析；PSORT WWW Server(https://psort.hgc.jp/)进行蛋白质亚细胞定位分析；SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html)对蛋白质二级结构进行预测；以SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)对蛋白质三级结构进行同源建模；利用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)对蛋白质磷酸化位点进行分析。

2 结果与分析

2.1 NsAKT 1基因克隆及测序

通过同源克隆，从N.sylvestris扩增出1条大于2 000 bp的亮带，该片段依次经电泳、回收、T载体连接和大肠杆菌导入后送由华大基因科技有限公司测序。利用DNAMAN对测序结果进行拼接、连接，得到全长为2 682 bp的基因序列。通过NCBI比对，克隆片段基因与普通烟草(N.tabacum)和绒毛烟草(N.tomentosiformis)类AKT 1通道蛋白基因(FJ 233071.1和XM_009621194.3)、宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)KT 1通道蛋白基因(KU 523244.1)、黑枸杞(Lyciumruthenicum)AKT 1通道蛋白基因(KY 465774.1)、番茄(Solanumlycopersicum)LKT 1通道蛋白基因(NM_001247329.3)分别有100%、100%、98%、98%和98%的序列一致度。说明利用同源克隆，从林烟草中得到了NsAKT1基因，且该基因在相同物种中保守性较高。

注：M为DNA 2 000 bp Marker；N为Negative control；P为Positive control；S为Sample。 图2 目标片段的PCR扩增

2.2 NsAKT 1基因编码序列分析

用DNAMAN对NsAKT1基因进行分析，得到NsAKT 1蛋白序列。分析后可知：烟草AKT1基因开放阅读框长度为2 682 bp，编码893个AA，分子量为100.375 kDa。带电荷氨基酸217个，占24.3%；碱性氨基酸100个，占11.2%；酸性氨基酸117个，占13.1%；极性氨基酸234个，占26.2%；疏水性氨基酸47个，占5.2%。含量最多的是亮氨酸(Leu)，达到12.2%，含量最少的是色氨酸(Trp)，只占1.2%。该蛋白等电点为6.54，负电残基(Asp+Glu)有100个，正电残基(Arg+Lys)有95个，原子总数14 103，分子式简写为C4500H7083N1241O1307S32。脂肪族系数为97.25，不稳定指数为34.76，总平均亲水性-0.104。

注：Ser为色氨酸；Thr为苏氨酸；Tyr为络氨酸。 图4 AKT 1磷酸化位点预测位置

2.3 NsAKT 1蛋白亲疏水性分析及信号肽预测

利用在线分析软件ProScale(http://web.expasy.org/ProScale)对AKT 1蛋白的亲疏水性进行分析。已知，疏水性代表正值，亲水性代表负值。分析可知，数值超过2的有5个峰值，分别在75～76位，115位，210位，425位及579位，最大值为2.956；数值低于-2的有11个峰值，较为突出的4个峰值分别在66位，560位，768位及881位，最小值为-3.233。根据以上分析判断，该蛋白是一个亲水性蛋白。同时，利用在线分析软件SignalP 4.0预测蛋白信号肽表明，烟草AKT 1蛋白信号肽分析(图3)，C-max位点为22，C-score≒0.116；Y-max位点为4，Y-score≒0.143；S-max位点为20，S-score≒0.200；D≒0.169；SP≒‘NO’，说明烟草AKT 1蛋白没有信号肽，不是分泌性蛋白。

2.4 NsAKT 1蛋白跨膜结构域预测

利用在线分析软件TMpred Server对林烟草AKT 1 蛋白跨膜结构域进行预测，结果显示有6个跨膜区域，如图6。第1个跨膜区域，从第71位氨基酸到第91位氨基酸，长度为21个氨基酸，方向为o-i；第2个跨膜区域，从第104位氨基酸到第122位氨基酸，长度为19个氨基酸，方向为i-o；第3个跨膜区域，从第206位氨基酸到225位氨基酸，长度为20个氨基酸，方向为o-i；第4个跨膜区域，从第249位氨基酸到第269位氨基酸，长度为21，方向为o-i；第5个跨膜区域，从第283位氨基酸到第305位氨基酸，长度为23，方向为o-i；第6位跨膜区域，从第568位氨基酸到第586位氨基酸，长度为19，方向为i-o。利用在线分析软件TMHMM Server v. 2.0对其结构域进行分析，进一步确认烟草AKT 1蛋白的跨膜结构域有6个。

注：h为α螺旋；t为β折叠；c为β转角；e为无规卷曲。 图5 AKT 1二级结构各组成位置及空间构型预测

2.5 NsAKT 1蛋白亚细胞定位及磷酸化位点预测

利用在线分析软件PSORT WWW Server对该蛋白亚细胞定位预测可知，AKT 1蛋白定位于内质网膜(0.685)、质膜(0.640)、高尔基体(0.460)及内质网中(0.100)。利用在线预测软件NetPhos 3.1 Server 对AKT 1蛋白的磷酸化位点进行预测，结果如下(图4)，已知阈值大于0.5证明该位点磷酸化，丝氨酸(S)磷酸化位点有40个，苏氨酸(T)磷酸化位点有24个，酪氨酸(Y)磷酸化位点有3个。

2.6 NsAKT 1蛋白二级与三级结构预测

利用在线分析软件SOPMA预测林烟草AKT1编码蛋白的二级结构，结果(图5)显示，目的蛋白的二级结构中，40.6%氨基酸残基组成α螺旋、15.6%氨基酸残基组成延伸链、7.2%氨基酸残基组成β转角以及36.6%氨基酸残基组成无规卷曲。其中363个氨基酸残基组成48个α螺旋(α-helix)、139个氨基酸残基组成35个延伸链(extended strand)、64个氨基酸残基组成36个β转角(β-turn)及327个氨基酸残基组成59个无规则卷曲(random coil)。无规则卷曲将前三者连接起来。利用在线分析软件SWISS-MODEL对目的蛋白进行三级结构同源建模(图6)。

图6 AKT 1三级结构预测模型

3 讨 论

钾(K)是植物生长发育必需的大量营养元素之一，主要通过根细胞的K+通道及转运蛋白介导吸收。AKT 1是Shaker型K+通道家族的重要成员，在植物根吸收K+和体内跨膜转运中发挥重要作用。本研究以林烟草(N.sylvestris)为材料，利用同源克隆方法从中扩增得到全长NsAKT1基因。核酸序列分析表明，该基因长度为2 682 bp，可编码893个AA的蛋白，与拟南芥(A.thaliana)AKT 1编码857个AA[23]、陆地棉(upland cotton)AKT 1编码875个AA[24]有一定长度差异，暗示AKT 1通道蛋白的大小在远缘物种中表现出一定氨基酸数目的差异，同时也存在物种间的保守性。进一步对NsAKT1蛋白跨膜结构域、信号肽及亲疏水性预测发现，林烟草钾离子通道AKT 1蛋白含有6个跨膜区域，不含信号肽，为亲水性蛋白。王英琪等[22]研究大豆(Glycinemax)AKT 1时也提出，大豆GmAKT 1通道蛋白有5个跨膜区域，为亲水性蛋白，在根部表达量最高，这说明GmAKT 1在大豆钾离子吸收中有重要作用。本研究利用TMHMM及Tmpred软件预测了NsAKT 1的跨膜结构域，使用TMHMM的预测结果与王英琪等[22]预测GmAKT 1结果相一致，大豆和林烟草的NsAKT 1均为5个跨膜结构域；但Tmpred预测结果表明，NsAKT 1为6个跨膜结构域，推测2种软件在对氨基酸序列进行计算时存在一定的阈值范围，故而导致分析的结果有一定的差异。但两种软件都预测到了NsAKT 1具有的前5个跨膜结构域，暗示林烟草AKT 1至少由5个跨膜结构域组成。

通过对NsAKT 1氨基酸理化性质分析表明，脂肪族系数为97.25，不稳定指数为34.76，总平均亲水性-0.104，酸性氨基酸有117个，碱性氨基酸有100个，理论等电点为6.54，负电残基(Asp + Glu)有100个，正电残基(Arg + Lys)有95个，结合吴毕莎等[25]研究蛋白质酸碱性的判断方法，推断NsAKT 1为一个酸性蛋白。蛋白质亲疏水性预测结果显示，该蛋白最大数值为2.956，最小数值为-3.233，正值超过2的有5个峰值，低于-2的有11个峰值，总体分析后得出该蛋白为亲水性蛋白，与Dennison等[26]的研究结果相一致。在蛋白质磷酸化位点分析中，预测色氨酸(tryptophan，Trp)、苏氨酸(threonine，Thr)及络氨酸(tyrosine，Tyr)磷酸化位点各40、24、3个。亚细胞定位预测表明，林烟草AKT 1基因编码的蛋白主要定位于内质网膜、高尔基体等部位。进一步对NsAKT的高级结构预测，得到该蛋白的二级结构主要由48个α螺旋(α-helix)、35个延伸链(extended strand)、36个β转角(β-turn)及59个无规则卷曲(random coil)组成，而无规则卷曲将前三者连接起来。以上结果为进一步研究N.sylvestris中AKT1基因功能提供了理论依据。