CRSwNP患者YKL-40、TLR4基因表达及嗜酸性粒细胞水平与复发的相关性

董春花 张英 岳光浩

慢性鼻-鼻窦炎（chonic sinusitis，CRS）是发生在鼻-鼻窦的持续12 周以上的慢性炎性反应，有较高的发病率。该症主症为鼻塞或黏脓涕，次要症状为头部、脸面部胀痛及嗅觉障碍，此外在鼻内镜检查中还可见中鼻道、嗅裂有分泌物，鼻粘膜呈充血、水肿状态或出现息肉［1］。CRS 伴鼻息肉（chonic sinusitis with nasalpolyp，CRSwNP）是CRS的亚型之一，感染、免疫、鼻腔结构异常、鼻粘膜功能异常及基因遗传等均是该症发生的基本病因。由于该症有一定复发性，对参与预后及复发的相关指标进行观察于临床治疗有重要意义。CRSwNP的组织学类型主要有嗜酸性粒细胞（eosinophi，EOS）型及非EOS 型，EOS 是鼻息肉的重要致病物质，可参与炎症的发展过程［2］。几丁质酶3 样蛋白1（chitinase-3-like protein 1，YKL-40）是人类组织中最多见的糖蛋白，研究表明其为炎症标志物之一，在众多疾病的发生中起着关键作用［3］。Toll 样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）作为Ⅰ型跨膜糖蛋白受体，可诱导核因子活化B 细胞κ 轻链增强子（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号通路的激活，进而促进炎症反应［4］。本研究就CRS 伴鼻息肉患者YKL-40、TLR4 及EOS 的变化与其预后复发的相关性进行研究，探讨其在CRSwNP 患者发生和发展中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年5月至2019年1月本院收治的159 例CRS 患者资料，按是否伴息肉分为伴息肉组（n=84）、不伴息肉组（n=75），纳入标准：均满足《中国慢性鼻窦炎诊断和治疗指南（2018）》诊断标准［5］者；临床资料完整；排除标准：入组前1月内接受糖皮质激素类药物、抗菌药物治疗者，存在肿瘤、免疫系统疾病、其他呼吸道疾病及高血压、糖尿病、冠心病、高血脂等基础疾病者。选取同期本院收治的71 例单纯外伤性鼻中隔偏曲患者作为对照组，3 组性别、年龄、体重、吸烟史等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 3 组一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of general data of the 3 groups（±s）

表1 3 组一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of general data of the 3 groups（±s）

组别伴息肉组不伴息肉组对照组F/χ2值P 值n 84 75 71性别（男/女）45/39 42/33 40/31 0.147 0.929年龄46.13±5.33 45.79±5.48 46.21±5.31 0.13 0.880 BMI（kg/）21.79±1.35 21.85±1.27 21.66±1.29 0.40 0.669吸烟史46 43 41 0.169 0.919

1.2 方法

1.2.1 研究方法

收集所有研究对象临床及随访资料，记录所有患者YKL-40、TLR4、NF-κB、EOS 水平及CRSwNP 患者预后复发情况，采用多元Logistic 分析影响复发的危险因素。

1.2.2 YKL-40、TLR4 及EOS 水平检测方法

采集所有研究对象鼻窦粘膜，使用生理盐水清洗表面后保存在10%甲醛溶液中并置于-80℃恒温箱，分为三份。YKL-40、TLR4、NF-κB 检测：3 组留取标本经生理盐水冲洗后保存于-70℃冰箱中备检。检测方法采用荧光染料法反转录实时荧光定量PCR：取出冻存的组织，采用TRIZOL 总RNA 提取试剂盒（美国Invitorgen 公司）提取总RNA，按试逆转录试剂盒（武汉默沙克生物科技有限公司）将总RNA 逆转录，得到cDNA，以cDNA 为模板用PCR 试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）进行检测。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，其中，YKL-40 引物序列上游：5′-TGAG-GCATCGCAATGTAAG-3′ ，下游：5′-AAGGGGAAG-TAGGATAGGGG-3′；TLR4 引物序列上游：5′-TGTC-CTCCCACTCCAGGTAAGT-3′，下游：5′-GATTGCT-CAGACCTGGCAGTT-3′；NFκB 序列上游：5′-TCCAGAAGTATTTCAACCACAG-3′，下游：5′-GCCT-TCACATACATAACGGA-3′。PCR 反应条件：连续反应38 个循环，分别是90℃60 s；92℃30 s；56℃30 s；74℃30 s。每个标品均设3 个平行反应复孔，参照每孔Ct 值进行分析。外周血EOS 来自入组时血常规检测。

1.2.3 随访及治疗

所有伴鼻息肉患者均行内镜下鼻窦术治疗，自出院后开展随访（电话随访及面对面随访），随访时间截止2020年4月。随访中若患者症状未缓解，可给予激素治疗。复发标准［5］：鼻塞、流涕、嗅觉障碍等症状评分；采用视觉模拟量表（VAS）［6］评价：0 分、0～3 分轻度、4～7 分重度、8～10 分重度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0 软件进行统计分析，计量资料采用（±s）描述，两组间用t检验，多组间用F检验；计数资料用n（%）表示，采用χ2检验；影响CRSwNP 患者复发的危险因素使用Logistic回归分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组YKL-40、TLR4、NF-κB 表达情况、外周血及组织EOS 比例比较

伴息肉组YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA 水平、外周血及组织EOS 比例较未伴息肉组和对照组高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 3 组YKL-40、TLR4、NF-κB mRNA 水平及组织EOS 比例比较（±s）Table 2 Comparison of YKL-40，TLR4，NF-κB mRNA levels and tissue EOS proportion in the 3 groups（±s）

表2 3 组YKL-40、TLR4、NF-κB mRNA 水平及组织EOS 比例比较（±s）Table 2 Comparison of YKL-40，TLR4，NF-κB mRNA levels and tissue EOS proportion in the 3 groups（±s）

组别伴息肉组不伴息肉组对照组F 值P 值n 84 75 71 YKL-40 mRNA 0.97±0.31 0.71±0.25 0.49±0.13 73.67＜0.001 TLR4 mRNA 0.93±0.15 0.67±0.13 0.43±0.12 265.94＜0.001 NF-κB mRNA 0.89±0.13 0.65±0.11 0.31±0.05 595.57＜0.001组织EOS 比例（%）4.97±1.57 3.21±1.56 2.19±1.03 76.50＜0.001外周血EOS 计数（L-1，×109）0.31±0.12 0.14±0.05 0.07±0.01 196.26＜0.001

2.2 CRSwNP 患者复发情况

84 例伴息肉组患者截至随访前共有45 例复发，复发率为53.57%；按是否复发分为复发组（n=45）及非复发组（n=39）。

2.3 影响CRSwNP 患者复发的单因素分析

复发组和非复发组在年龄、性别、外周血淋巴细胞比例、流涕评分及鼻塞评分比较差异无统计学意义（P＞0.05），而复发组合并哮喘比例、嗅觉障碍评分、YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA 水平及外周血、组织EOS 比例较非复发组高，组织淋巴细胞比例及组织浆细胞较复发组低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 影响CRSwNP 患者复发的多因素分析

高YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA 表达量及组织EOS 增多是影响CRSwNP 患者复发的独立危险因素（P＜0.05）。见表4。

3 讨论

CRSwNP 患者的临床症状可随鼻息肉体积的增大而加重，且常并发支气管哮喘、分泌性中耳炎等症状，进而对呼吸系统造成一定影响，造成生活质量的降低。CRSwNP 的发病机制较为复杂，目前主要存在细菌生物膜、超抗原及变态反应三种假说。YKL-40 是一种分泌型糖蛋白，属于18 糖基水解酶家族，近年的研究表明其可识别细胞外基质中的透明质酸，并可在炎症反应的细胞增殖、分化及组织重塑等病理过程中发挥重要作用［7］。周凌等［8］研究显示，血清YKL-40 与社区获得性肺炎的发病有关。类似的，何作华等［9］研究发现重症肺炎患者体内YKL-40 水平显著升高，提示YKL-40与炎症性疾病有密切关系。

表3 影响CRSwNP 患者复发的单因素分析（±s）Table 3 Single factor analysis of the influence on the recurrence of CRSwNP patients（±s）

类别性别年龄（岁）外周血淋巴细胞比例（%）鼻塞评分（分）流涕评分（分）合并哮喘（n）嗅觉障碍评分（分）YKL-40 mRNA TLR4 mRNA NF-κB mRNA组织EOS 比例（%）外周血EOS 计数（L-1，×109）男女复发组（n=45）23 22 47.33±5.11 35.86±5.31 7.45±1.05 5.89±2.13 13 4.95±1.03 1.13±0.51 1.19±0.23 1.31±0.65 5.23±1.57 0.55±0.13非复发组（n=39）15 14 47.51±5.27 34.89±5.36 7.37±1.13 5.21±2.01 3 1.24±0.86 0.85±0.43 0.91±0.15 0.89±0.51 4.55±1.39 0.29±0.11 t/χ2值0.003 0.159 0.831 0.336 1.498 6.088 17.757 2.697 6.496 3.258 2.087 9.810 P 值0.959 0.874 0.408 0.738 0.138 0.014 0.001 0.009 0.001 0.002 0.040 0.001

表4 影响CRSwNP 患者复发的多因素分析Table 4 Multivariate analysis of the influence of recurrence in crswnp patients

NF-κB 作为一种核转录因子，可参与炎症反应、肿瘤生成和细胞凋亡，是机体免疫系统重要的组成部分［11］。TLR4 作为一种跨膜蛋白，其胞外大量的亮氨酸重复序列结构域对结合配体功能有重要意义［12］。近年来YKL-40、TLR4、NF-κB在CRSwNP 发病机制中的作用受到关注，本研究结果证实YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA 水平变化可体现CRSwNP 发生和发展程度。

EOS 颗粒由于含有大量毒性产物，包括嗜酸细胞阳离子蛋白、白三烯、趋化因子等，可造成气道解剖结构和功能的异常，导致多种呼吸道疾病的发生［13-14］。此外，EOS 活化后嗜酸细胞阳离子蛋白呈高表达状态，可加速炎性浸润［15］。本研究结果表明CRSwNP 患者鼻粘膜炎性浸润严重。

相关研究指出CRSwNP 患者复发率可达50%～70%［16］，因此经手术治疗后再次手术率较高。本研究结果基本与既往研究报道相似。进一步分析影响CRSwNP 患者复发的相关因素，马越等［17］通过收集22 例CRSwNP 患者临床资料，发现YKL 在CRSwNP 鼻窦粘膜组织中高表达，且与TLR4 呈负相关，提示二者可能存在交互作用，同时参与CRSwNP 患者病情的发展。而本研究通过将相关的变量纳入Logistic回归分析结果说明高YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA 表达量及组织EOS 增多可作为预测CRSwNP 预后复发的相关指标。

综上所述，本研究提示YKL-40、TLR4、NF-κB及组织EOS 比例在CRSwNP 中呈高表达，可作为影响CRSwNP 预后复发的独立危险因素，对临床预测CRSwNP 患者病情发展有重要意义。