湖北汉族人群ALK、EGFR和ROS1基因多态性与非小细胞肺癌易感性相关分析

沈智俊 刘世国

近10年来，肺癌的发生率逐年提高。大多数肺癌患者在初次诊断时就已经有转移。即使在之后行根治性切除术，5年生存率只有25～30%。所有肺癌病例中，非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）约占85%［1］。肺癌是环境和遗传因素相互作用的结果，其遗传因素在其发生发展中的作用越来越受到人们的重视。许多学者对单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和肺癌易感性之间的关系进行了深入的研究，并取得了良好的效果［2］。目前，关于NSCLC 易感基因单核苷酸多态性的研究，我国已有开展，但湖北地区汉族人群却研究较少。将这些易感基因的单核苷酸多态性位点作为风险因素或可疑信号，运用到肿瘤个体化治疗的诊断还需要进一步验证。本研究采用高通量实时多聚酶链反应（PCR）评估湖北地区汉族人群NSCLC 患者相关基因单核苷酸多态性突变型的情况，为肺癌综合防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本信息

选取2016年1月到2018年1月，本院收集的51 例NSCLC 患者的样本作为患者组。其中，男性36 人（70.6%），女性15 人（29.4%），平均年龄（62.4±14.1）岁。入选标准包括：①进行过X 光或CT 检测，发现有肺部阴影；②通过细胞组织病理切片确诊为NSCLC；③患者只有NSCLC 而没有其他器官的恶性肿瘤。排除标准为：①本次治疗以前该患者被诊断过其他恶行肿瘤；②本次治疗以前该患者执行过放疗或手术治疗；③该患者同时患有严重的内分泌疾病；④该患者同时患有心脑血管疾病；⑤该患者同时患有慢性肝脏和肾脏功能异常；⑥该患者有精神障碍，不能正常交流。同时收集了64 位健康人作为对照组，包括男性35 人（54.7%），女性29 人（45.3%），平均年龄（61.8±15.3）岁。入选标准为：①没有肿瘤患病史或肿瘤临床特征；②入选者之间没有血缘关系。对照组的排除标准同患者组。所有患者及家属均已签署知情、同意书。本研究经本医院医学伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

核酸提取采用离心柱型DNA 提取试剂盒（DP318，天根生化科技（北京）有限公司）；引物合成及PCR 试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸定量采用NanoDrop One/OneC 微量紫外-可见光分光光度计（Thermo Scientific，中国）进行；PCR扩增仪为GeneAmp®PCR system9700（Applied Biosystem，中国）。

1.3 方法

本研究通过调查问卷的形式获取样本的相关信息，每位入选者抽取外周静脉血5 mL，EDTA 抗凝，放-20℃备用。待入组完成后，按DNA 提取试剂盒说明书对人外周血样本进行核算提取。采用NanoDrop 分析仪对各DNA 样本进行浓度测定及质量评价。确定符合后续实验条件后，取10 μL 进行PCR 扩增，反应条件为94℃5 min；以下3 个温度循环32 次：94℃30 s，57℃35 s，72℃40 s。然后将扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，分析各SNP 位点突变情况。SNP 检测位点及其PCR 引物见表1。

表1 SNP 检测位点及PCR 引物Table 1 SNP and PCR primers

1.4 统计分析

采用SPSS 25.0 软件进行数据分析。计量资料采用（±s）表示，用t检验，计数资料用n（%）表示，采用χ2检验；对于基因的多态性位点与NSCLC 的相关性采用logistic 单因素分析；对于基因的多态性位点与NSCLC 的因果关系，本研究选择显性模型，采用非条件二分类logistic 回归分析，计算优势比，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 临床数据

入选的研究人群中，有吸烟史的人数，NSCLC患者组较健康人群组多，但截至入组时还在吸烟的人数，NSCLC 患者组较健康人群组无统计学差异。测序结果表明，NSCLC 患者的ALK、EGFR、ROS1单核苷酸多态性突变的阳性率都要比健康人群高，特别是EGFR单核苷酸多态性突变型（P＜0.05）。见表2。

2.2 ALK、EGFR、ROS1 的单核苷酸多态性突变与NSCLC 的相关分析

Logistic 单因素分析表明，ALK的rs113994090和rs113994092 突变型与NSCLC 易感性显著性相关（P＜0.05）；EGFR的rs28929495，rs121434568，rs121434569，rs12193428，rs121913465，rs397517127，rs606231253 也与NSCLC 易感性显著性相关（P＜0.05），但ROS1位点与NSCLC 易感性的相关性无显著性差异（P＞0.05）。见表3。

2.3 ALK、EGFR、ROS1 的单核苷酸多态性突变对于NSCLC 易感性的优势比

Logistic 回归分析结果表明，EGFR的几个单核苷酸多态性突变型均是NSCLC 易感性的风险因素，其中优势比最高的位点是rs121434569；ALK与NSCLC 易感性的患病风险比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表2 两组临床资料对比［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of clinical data in the two groups［n（%），（±s）］

表2 两组临床资料对比［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of clinical data in the two groups［n（%），（±s）］

注：a 为采用fisher 精确概率法计算。

类别平均年龄（岁）性别男性女性入组时有肝转移例数吸烟史从不现在吸以前吸癌胚抗原（CEA）（ng/mL）NSCLC 分型腺癌鳞癌其他ALK 突变比率阳性阴性EGFR 突变比率阳性阴性ROS1 突变比率阳性阴性健康人群组（n=64）61.8±15.3 NSCLC患者组（n=51）62.4±14.1 t/χ2值0.196 3.038 P 值0.8045 0.087 35（54.7）29（45.3）-36（70.6）15（29.4）32（41.2）28（43.8）26（40.6）10（15.6）2.76±1.65 9（17.6）14（27.5）28（54.9）259.89±345.51 8.862 2.172 19.790 0.003 0.141＜0.001---46（90.2）3（5.9）2（2.9）5.123a 0.024 1（1.6）63（98.4）3（4.7）61（95.3）0（0）64（100）6（11.8）45（88.2）31（60.8）20（39.2）3（5.9）48（94.1）42.890＜0.001 3.866a 0.049

3 讨论

不同个体对环境因素造成的影响是有差异的，造成这种差异的一个重要的内在因素就是单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）。人类基因组目前已发现1.5×107个SNP 位点，每隔300～600 bp 就有一个［3］。关于NSCLC 易感性与SNP 的关联分析一直是热点，近期的研究包括：维生素D 信号通路的相关分子［4］，端粒酶TERT基因［3-4］，TOP2A和ERCC1［5］，miR-423-3p 基因拷贝数变异［6］，非转移性细胞1 基因［7］，IL-17F 和IL-17A［8］等，均与NSCLC 易感性相关。本研究通过分析全基因组关联（Genome-wide association，GWAS）数据库（https：//atlas.ctglab.nl/）［9］，备选了ALK、EGFR、ROS1的几个位点，研究在湖北汉族人群中，其SNP 与NSCLC 的易感性是否相关。

表3 ALK、EGFR、ROS1 基因多态性logistic 单因素分析Table 3 Univariate analysis of polymorphism of ALK，EGFR and ROS1 by logistic regression

表4 ALK、EGFR、ROS1 基因二分类logistic 回归分析Table 4 Binary Logistic Regression analysis of ALK，EGFR and ROS1 genes

ALK是间变性淋巴瘤激酶基因，其重排可诱导NSCLC［10］，不同人群NSCLC 患者的ALK阳性突变的比率在1.4～13%之间［11］。尤其是NSCLC Ⅳ期患者，ALK阳性突变的比率相比其他几个NSCLC 分期都要高［12］。本研究进一步明确了ALK与NSCLC发生的相关关系，但并非患病的危险因素。

EGFR是表皮生长因子受体基因，其致癌突变在低分化型和预后不良的NSCLC 患者中很常见，90%的EGFR突变存在于18-21 外显子中［13］。其突变的频率在不同种族之间差异较大，Kosaka 等［14］报道，日本人群的突变频率要显著高于欧美人群。而我国的研究发现，中国人群的突变频率甚至达30%［15］。本研究表明，EGFR的突变型频率在选取的三个基因中最高，这也与国际上的研究结果一致。本研究选取的EGFR各单核苷酸多态性位点均与NSCLC 的易感性显著相关，其中，rs121434568，rs121434569，rs12193428，rs121913465 是NSCLC 患病的危险因素。曾有报道EGFR的rs2293347 位点与吉非替尼临床疗效相关［16］，笔者推测这几个位点也是通过突变改变了EGFR 受体的生物学功能，进而影响了疾病的发生，确切机制还需要进一步研究。

ROS1是c-ros 肉瘤致癌因子基因，在NSCLC的患者中有ROS1重排的发生，但其重排的发生率不及EGFR和ALK的突变率高［17］。ROS1的重排多发于年轻的非吸烟的NSCLC 患者中，这与其他几种突变不同（EGFR突变/KRAS突变/ALK重排）。有研究通过原位杂交检测ROS1的重排，发现其比率仅为1.7%［18］。本研究中，ROS1的单核苷酸多态性突变与NSCLC 之间的相关性无显著差异，因此未能分析其易感性，这很有可能是笔者的数据较少导致，需增加临床病例以确定最终结论。

NSCLC 的病理分型中，肺腺癌占比最多，约50%，其次是鳞癌，约30%［6］，而本研究收集的样本大部分为腺癌，鳞癌样本较少，导致分析数据有一定的偏向性。另外，本研究选择显性模型进行统计分析，因为在将杂合型与纯合型突变分别分析时，发现与将二者合并分析得到了一致的统计学结论。由于技术原因，很多分析不能进行，例如部分位点存在连锁不平衡，可能会影响最终结果判断。同时，肿瘤作为一种系统性疾病［19］，不仅是遗传因素，环境因素和心理因素的影响同样重要，本研究模型未将是否吸烟这一因素加入，导致其有一定的局限性。即便如此，目前包括miRNA 及LncRNA 的SNP 与疾病的相关性研究还是越来越多［20-21］，这些相关分析有利于解释个体的不同个体对系统性疾病的易感性以及对各种药物的耐性和对环境因素反应的差异，是后续研究的基础。本研究下一步将从生物学功能的角度，探讨SNP 与系统性疾病的因果关系，为肿瘤诊断与预防提供理论支持。