胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（探针杂交法）的评价

张文新 于婷 贾峥 孙楠 孙晶 黄杰 曲守方

染色体数目异常和结构异常导致新生儿出生缺陷，其中21 三体、18 三体、13 三体是临床上最常见的染色体疾病［1-2］。目前21 三体、18 三体和13 三体的检测方法主要有血清学筛查、无创产前检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）［3-4］、细胞核型分析和单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphism microarray，SNP-array）等分子生物学方法［5-6］，其中基于高通量测序平台的NIPT 技术目前已被广泛应用于胎儿染色体非整倍体产前筛查。

随着分子生物学技术在临床检测领域的发展，基于不同平台的胎儿染色体非整倍体检测技术方法不断涌现。胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（探针杂交法）是通过特异性探针捕获21 号、18 号、13 号及Y 染色体上的目标片段，捕获后的片段与设计好的核酸骨架结构连接成环，对DNA 环进行恒温滚环扩增延长，对延长的多拷贝DNA 进行染色体特异的荧光标记，在显微成像设备上只针对21 号、13 号和18 号染色体上的DNA片段进行计数分析，评估胎儿患T21、T18 或T13 综合征的风险［7］。中国食品药品检定研究院（简称中检院）研制的基于SNP 检测方法的胎儿染色体非整倍体（21 三体、18 三体和13 三体）国家参考品，可以用于该技术方法试剂盒的评价。本研究通过应用该探针杂交法试剂盒对国家参考品进行检测，以评价该技术方法试剂盒的检测性能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 国家参考品

基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）检测方法的胎儿染色体非整倍体（21 三体、18 三体和13 三体）国家参考品，包括3 份正常人样本，72 份模拟胎儿游离DNA 不同比例的21 号、18 号、13 号染色体非整倍体异常样本，9 份微缺失微重复样本和20 份其他染色体非整倍体异常的样本，中检院提供。

1.1.2 试剂

胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（探针杂交法），全自动核酸处理系统（Easy Core）和全自动荧光显微成像分析仪（Easy View），苏州新波生物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 血浆游离DNA 提取

采用试剂盒说明书指定的游离DNA 提取试剂盒（磁珠法）和全自动核酸提取仪对国家参考品血浆样本和阴、阳性质控品进行游离DNA 提取和纯化。

1.2.2 游离DNA 的处理

将带有游离DNA 的洗脱板放入到Easy Core仪器，打开Easy Core 软件登录进入操作界面，点击“滚环扩增”进入样本选择界面，选择样本（提取后的洗脱板）。确认试剂和耗材摆放，然后运行仪器。经过内切酶剪切游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）、探针捕获cfDNA 片段后与骨架DNA 连接成环、消化残余单链线性DNA、滚环扩增延长cfDNA 片段和染色体特异荧光标记等步骤，转移产物至检测板，运行结束后把检测板小心取出。

1.2.3 信号读取

将检测板小心放入Easy View 托盘上，注意A1 孔朝左上方（条形码在右侧），运行Easy View仪器。扫描检测板条形码，随后仪器进行自检，自检通过后开始信号读取。仪器对检测板每一个孔位的121 个区域进行拍照，每个区域在每个荧光通道拍1 张照片，包括chr21、chr13、chr18、chrY 共4个检测通道。每个孔位拍照结束后会根据总的荧光点数（counts）和所拍区域的数量计算出该孔位荧光点的密度（density）。

1.2.4 结果分析

使用无创产前筛查风险分析软件，从每份样本拍照计数得到的21 号、18 号和13 号染色体的荧光信号（density）计算三者之间的相对比例（raw_ratio），再通过Levenberg-Marquardt 进行回归分析得到三者校正后的比例（Norm_ratio），计算Z 值，评估样本的21 号、18 号和13 号染色体三体的风险。

2 结果

2.1 国家阳性参考品、阴性参考品及T18 微重复参考品结果

取三批试剂盒，每批试剂重复检测3 套相同的国家参考品。在9 次测试中，国家参考品中15 例10%胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）比例的T21 阳性参考品和32 例阴性参考品的结果表明，T21 阳性参考品均检出T21 高风险（high risk），阴性参考品均未出现T21 高风险或T21 灰区（grey zone）。国家参考品中6 例10%胎儿游离DNA 比例的T18 阳性参考品、2 例T18 微重复参考品和32 例阴性参考品的结果表明，T18 阳性参考品均检出T18 高风险，chr18 微重复参考品97-Rep-Dup-5 和100-Rep-Dup-8 检出T18 高风险，阴性参考品均未出现T18 高风险或T18 灰区。国家参考品中3 例10%胎儿游离DNA 比例的T13 阳性参考品和32 例阴性参考品的结果表明，T13 阳性参考品均检出T13 高风险，阴性参考品均未出现T13 高风险或T13 灰区。见图1。

图1 10%cffDNA 比例国家参考品结果Figure 1 The results of national reference materials with 10%cffDNA fraction

2.2 国家检测限参考品结果

对于国家检测限参考品，24 例5%胎儿游离DNA 比例检测限参考品在9 次测试中均正确检出，而24 例3.5%胎儿游离DNA 比例检测限参考品在9 次测试中的正确检出率分别为75%～92%。第一批次试剂盒对24 例5%检测限参考品和24 例3.5%检测限参考品共48 例样本的3 次重复检测结果，见表1，三批试剂盒对24 例5%检测限参考品和24 例3.5%检测限参考品的检出率统计结果。见表2、表3。

3 讨论

1997年，香港中文大学卢煜明教授发现孕妇外周血游离DNA 中存在胎儿成分［7］，基于这一研究，无创产前基因检测（Noninvasive prenatal genetic testing，NIPT）技术为胎儿染色体非整倍体检测开辟新的方向，同时随着高通量测序技术的发展，21 三体、18 三体、13 三体的NIPT 技术逐渐成熟并在产前筛查中广泛应用。目前，21 三体、18 三体、13 三体的NIPT 技术多采用以全基因组低深度测序的高通量测序策略，国家药监局现已批准的NIPT 产品也均采用该方法学，该方法学在样本建库过程中不对来自不同染色体的DNA 序列加以区分，而是通过后续生物信息学分析识别其原始位置并通过分析每条染色体上检测到的碱基占所有检测到碱基的百分比来对染色体是否存在非整倍体进行判断。

随着分子诊断技术在临床应用上的发展，也出现了NIPT 技术应用的不同平台。Vanadis NIPT系统即可用于胎儿染色体非整倍体21 三体、18 三体和13 三体的检测，它包括Easy Extrac、Easy Core和Easy View 等三台设备和配套的专用图像分析软件以及胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（探针杂交法）。该试剂盒针对21 号、18号、13 号及Y 染色体各设计3 000 个探针，其结果分析基于正常样本群得出回归曲线，所以对每次测试中阴性样本的数目有要求。另外分析方法对每次测试中阳性样本所占的比例也有一定的规定，一般不应超过15%［8］。与高通量测序法相比，探针杂交法不对全部染色体核酸片段进行分析，

只针对21 号、18 号和13 号染色体上的DNA 片段，通过专用图像软件对来自不同荧光DNA 微球进行计数分析，因此不用通过生物信息分析具体的序列信息。同时由于该方法在捕获cfDNA 片段后，仅通过滚环扩增延长DNA 片段而不进行扩增，可减少PCR 扩增效率不同带来的偏移，且可降低体系污染的风险和可能性。

表1 国家检测限参考品结果Table 1 The result of national limited reference material

表2 5%胎儿游离DNA 比例检测限参考品的检出率结果Table 2 The detection rate of the limited reference with 5%cffDNA fraction

基于SNP 检测方法的胎儿染色体非整倍体（21 三体、18 三体和13 三体）国家参考品，包括染色体非整倍体、微缺失微重复和正常样本，适用于单核苷酸多态性（SNP）位点基因芯片法和基于SNP 位点的高通量测序法等。人群中胎儿DNA浓度分布的统计结果表明有接近一半样本中胎儿游离DNA 比例大于10%，超过96%样本中胎儿游离DNA 比例高于4%［9-10］。而胎儿游离DNA 比例是NIPT 技术准确度的主要因素，低胎儿游离DNA比例会导致假阴性结果的较高风险［8］。而国家检测限参考品要求5%胎儿游离DNA 比例检测限参考品检出率应不低于90%，3.5%胎儿游离DNA 比例检测限参考品检出率应不低于50%［9］。

三批试剂盒对国家参考品中104 例样本进行检测，结果均符合国家参考品的预期结果。9 次测试中，5%胎儿游离DNA 比例检测限参考品检出率均为100%，3.5%胎儿游离DNA 比例检测限参考品检出率最低为75%，最高可达到92%；微缺失微重复参考品中18 号染色体微重复的参考品均为18 三体。由此可见，该探针杂交法的试剂盒即使在低胎儿游离DNA 比例的情况下也能实现胎儿染色体非整倍体的较高检出率，保证胎儿染色体非整倍体的较准确检出。

应用基于SNP 检测方法的胎儿染色体非整倍体（21 三体、18 三体和13 三体）国家参考品对该探针杂交技术检测试剂盒进行评价，结果显示其阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、检测限和重复性均符合我国国家参考品的相关规定，性能均可到达我国国家参考品的要求。