宫颈病变与Treg转录因子表达及细胞因子水平的关系

梅琳琳 王雅莉 田晓娜 宋双

宫颈癌（cervical cancer）是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤，发病率及病死率均呈逐年升高趋势，严重威胁我国女性的健康［1-2］。近年来，越来越多的学者开始关注宫颈癌的发病机制，其中免疫逃逸与宫颈癌之间的关系被多项研究证实，多种免疫细胞在宫颈癌病灶及患者外周血中均存在异常［3-5］。调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）是CD4+T 细胞中具有免疫抑制作用的亚群，在转录因子Foxp3 的作用下分化成熟并通过分泌白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）以及转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）来实现对免疫应答的负性调控，能够抑制机体的抗肿瘤免疫应答、促进肿瘤细胞发生免疫逃逸［6-8］。本研究将观察了宫颈癌组织中Treg 转录因子Foxp3 表达及细胞因子IL-10、TGF-β1 含量的变化并分析了其与临床病理特征、增殖基因表达的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选择2015年3月至2018年12月期间在本院接受手术切除的宫颈癌患者，入组标准：①经术后病理诊断为宫颈癌；②临床病理资料完整；③留取宫颈癌组织。④所有患者及家属均签署知情同意书。排除标准：①术前未接受放化疗、生物治疗；②既往有其他恶性肿瘤病史。选择同期在本院接受手术切除的宫颈上皮内瘤变（CIN）患者及接受子宫切除术的子宫肌瘤患者，分别留取CIN 组织及正常宫颈组织。宫颈癌患者共84 例，年龄38～62 岁、平均（47.62±7.23）岁；CIN 患者共38 例，年龄33～59 岁、平均（46.48±8.65）岁；子宫肌瘤患者共60 例，年龄38～64 岁、平均（48.14±9.14）岁。宫颈癌患者、CIN 患者、子宫肌瘤患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

采用RIPA 裂解液（上海碧云天公司）、BCA 试剂盒（上海碧云天公司），Foxp3、cyclinD1、p53 的单克隆一抗（SantaCruz 公司），IL-10、TGF-β1 的酶联免疫吸附法（Elisa）检测试剂盒（上海西唐公司），凝胶成像仪（Bio-rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 Foxp3、cyclinD1、p53 表达的检测

取适量宫颈癌组织、CIN 组织、正常宫颈组织，加入RIPA 裂解液提取蛋白，采用BCA 试剂盒检测总蛋白含量，取30 μg 总蛋白与上样缓冲液混合，加入聚丙烯酰胺凝胶后进行电泳、电转膜，用5%脱脂牛奶封闭NC 膜两小时后4℃孵育1∶1 000稀释的Foxp3、cyclinD1、p53、β-actin 第一抗体过夜；第二天用第二抗体孵育NC 膜两小时后加入ECL 显影液，在凝胶成像仪中曝光得到蛋白条带，以β-actin为内参、根据条带灰度值计算蛋白表达量。

1.3.2 IL-10、TGF-β1 含量的检测

取适量宫颈癌组织、CIN 组织、正常宫颈组织，加入RIPA 裂解液提取蛋白，采用Elisa 试剂盒检测IL-10、TGF-β1 的含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组组织中Foxp3 表达及IL-10、TGF-β1 含量的比较

与正常宫颈组织比较，宫颈癌及CIN 组织中Foxp3 的表达量及IL-10、TGF-β1 的含量均明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与CIN 组织比较，宫颈癌组织中Foxp3 的表达量及IL-10、TGF-β 1 的含量均明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1、表1。

图1 宫颈癌、CIN 及正常宫颈组织中Foxp3 的蛋白条带Figure 1 Protein bands of Foxp3 in cervical cancer，CIN and normal cervical tissues

表1 宫颈癌、CIN 及正常宫颈组织中Foxp3 表达量及IL-10、TGF-β1 含量的比较（±s）Table 1 Comparison of Foxp3 expression，IL-10 and TGF-β 1 Contents in each groups（±s）

表1 宫颈癌、CIN 及正常宫颈组织中Foxp3 表达量及IL-10、TGF-β1 含量的比较（±s）Table 1 Comparison of Foxp3 expression，IL-10 and TGF-β 1 Contents in each groups（±s）

注：与正常宫颈组织比较，aP＜0.05；与CIN 组织比较，bP＜0.05。

组织来源正常宫颈组织CIN 组织宫颈癌组织F 值P 值n 60 38 84 Foxp3表达量0.93±0.15 1.44±0.20a 1.89±0.41ab 189.938 0.000 IL-10（ng/mL）0.83±0.17 1.51±0.32a 2.11±0.52ab 237.751 0.000 TGF-β1（ng/mL）0.74±0.20 1.32±0.28a 1.89±0.44ab 203.475 0.000

2.2 宫颈癌中Foxp3、IL-10、TGF-β1 表达的相关性

宫颈癌中Foxp3 的表达量与IL-10、TGF-β1 的含量均呈正相关关系，r分别为0.351、0.283，P＜0.05。

2.3 不同临床病理特征宫颈癌组织中Foxp3 表达及IL-10、TGF-β1 含量的比较

不同年龄、病灶直径的宫颈癌组织中，Foxp3 的表达量及IL-10、TGF-β1 的含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；高危HPV 感染、FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ、低分化、有淋巴结转移的宫颈癌组织中Foxp3 的表达量及IL-10、TGF-β1 的含量明显高于无高危HPV 感染、FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移的宫颈癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同临床病理特征宫颈癌组织中Foxp3 表达量及IL-10、TGF-β1 含量的比较（±s）Table 2 Comparison of Foxp3 expression,IL-10 and TGF-β 1 Contents in cervical cancer tissues with different clinicopathological characteristics（±s）

表2 不同临床病理特征宫颈癌组织中Foxp3 表达量及IL-10、TGF-β1 含量的比较（±s）Table 2 Comparison of Foxp3 expression,IL-10 and TGF-β 1 Contents in cervical cancer tissues with different clinicopathological characteristics（±s）

临床病理特征年龄n 34 46病灶直径分类＜40 岁≥40 岁t 值P 值＜3 cm≥3 cm t 值P 值28 52高危型HPV 感染否是18 62 FIGO 分期46 34组织分化程度t 值P 值Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳt 值P 值低分化中高分化t 值P 值33 47淋巴结转移否是48 32 t 值P 值Foxp3 表达量1.95±0.48 1.88±0.37 0.737 0.463 1.99±0.51 1.85±0.35 1.448 0.152 1.51±0.34 2.21±0.62 4.580 0.000 1.58±0.31 2.19±0.59 5.990 0.000 2.13±0.66 1.64±0.28 4.549 0.000 1.67±0.33 2.14±0.62 4.407 0.000 IL-10（ng/mL）2.06±0.48 2.17±0.60 0.886 0.378 2.02±0.42 2.19±0.66 1.233 0.221 1.67±0.38 2.58±0.61 5.985 0.000 1.75±0.33 2.51±0.57 7.509 0.000 2.60±0.59 1.62±0.42 8.685 0.000 1.61±0.29 2.63±0.63 9.790 0.000 TGF-β1（ng/mL）1.86±0.51 1.93±0.36 0.720 0.474 1.85±0.34 1.95±0.52 0.916 0.362 1.45±0.34 2.32±0.51 6.796 0.000 1.58±0.38 2.20±0.47 6.520 0.000 2.26±0.50 1.51±0.37 7.713 0.000 1.40±0.30 2.37±0.56 10.050 0.000

2.4 各组组织中cyclinD1、p53 表达的比较

与正常宫颈组织比较，宫颈癌及CIN 组织中cyclinD1的表达量明显增加，p53的表达量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；与CIN 组织比较，宫颈癌组织中cyclinD1的表达量明显增加，p53 的表达量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2、表3。

图2 宫颈癌、CIN及正常宫颈组织中cyclinD1、p53蛋白条带Figure 2 Protein bands of CyclinD1 and p53 in cervical cancer,CIN and normal cervical tissues

表3 各组组织中cyclinD1、p53 表达量的比较（±s）Table 3 Comparison of CyclinD1 and p53 expression in each groups（±s）

表3 各组组织中cyclinD1、p53 表达量的比较（±s）Table 3 Comparison of CyclinD1 and p53 expression in each groups（±s）

注：与正常宫颈组织比较，aP＜0.05；与CIN 组织比较，bP＜0.05。

组织来源正常宫颈组织CIN 组织宫颈癌组织F 值P 值n 60 38 84 cyclinD1 0.92±0.16 1.26±0.20a 2.02±0.42ab 175.582 0.000 p53 1.05±0.23 0.55±0.08a 0.22±0.05ab 332.842 0.000

2.5 宫颈癌中Foxp3 表达量及IL-10、TGF-β1 含量与cyclinD1、p53 表达量的相关性

Foxp3 的表达量及IL-10、TGF-β1 的含量与CyclinD1 的表达量呈正相关，与p53 的表达量呈负相关，见表4。

表4 宫颈癌中Foxp3 表达量及IL-10、TGF-β1 含量与cyclinD1、p53 表达量的相关性Table 4 Correlation between Foxp3 expression，IL-10，TGF-β1 and CyclinD1，p53 expression in cervical cancer

3 讨论

免疫逃逸与多种恶性肿瘤的发生发展均存在密切关系。近年来，免疫逃逸在宫颈癌的发生发展过程中的作用也受到了越来越多的关注［9］，已有多项研究报道宫颈癌患者外周血中Treg 细胞的比例以及血清中Treg 细胞因子的含量均明显增多［10-12］。Treg 是具有免疫抑制作用的CD4+T 细胞亚群，Foxp3 是该细胞亚群的标志性转录因子，能够介导Treg 的分化成熟；分化成熟的Treg 能够分泌具有免疫抑制活性的IL-10、TGF-β1，抑制多种免疫细胞的分化成熟、免疫细胞因子的分泌，进而实现对免疫应答的负性调控［13-15］。

高危型HPV 感染是宫颈癌发病的独立危险因素，局部组织中感染高危型HPV 后，病毒基因会整合进入宿主细胞的基因组，引起宿主细胞内多种基因表达的改变，进而通过相应基因的功能来影响细胞的生物学特性［16］。本研究结果说明高危型HPV感染可能增加Foxp3 的表达并促进Treg 分化成熟、分泌IL-10 及TGF-β1；而不断分化成熟的Treg 又能介导免疫抑制作用、抑制免疫应答对病毒的清除，进而造成的高危型HPV 的持续感染。由此，高危型HPV 感染与Treg 分化成熟形成了相互促进、相互增强的循环，共同参与了宫颈癌的发生发展。

在宫颈癌的发生发展过程中，当宫颈癌细胞发生免疫逃逸后，癌细胞会出现过度的增殖、迁移、侵袭，进而引起肿瘤相应病理特征的改变。本研究通过分析不同病理特征宫颈癌中Treg 的差异可知：随着FIGO 分期增加、分化降低、淋巴结发生转移，Foxp3 的表达明显升高，说明Treg 的增加能够促进宫颈癌的病理进程。在宫颈癌的病理进程中，癌细胞的恶性增殖是重要的生物学特征，cyclinD1及p53是与增殖密切相关的基因，前者加速细胞周期并促进增殖，后者诱导细胞凋亡并抑制增殖［17］。研究发现Treg 的增多能够造成促增殖基因cyclinD1表达增多、增殖抑制基因p53表达减少，说明Treg 细胞功能的改变与增殖基因表达的异常有关。这也与宫颈癌病理特征的改变相吻合，进而说明Treg 增多促进了宫颈癌病情的发展。

综上所述，宫颈癌组织中Treg 转录因子Foxp3及细胞因子IL-10、TGF-β1 的表达明显增加且与病理特征有关，高危型HPV 感染可能是促进Treg分化成熟的因素之一，而Treg 分化成熟后又能够促进癌细胞的增殖并引起病情的发展。在今后的研究中，可以设计宫颈癌移植瘤动物模型来验证Treg 对肿瘤生长、肿瘤细胞增殖的影响。