腹型肥胖者外周血miR-21表达与代谢紊乱及糖尿病发病风险的关系

万红 燕树勋 王娴 张胜威

肥胖的发生率随着社会经济的发展和生活条件的提高而显著上升，而肥胖（尤其是腹型肥胖）与2 型糖尿病密切相关。研究腹型肥胖者外周血中与糖代谢紊乱及糖尿病发病相关的生物标志物，对预防和控制糖尿病具有重要意义。人体外周血中的微小RNA（microRNA，miR），近年来有越来越多研究表明其作为肿瘤等疾病发生、发展和预后的潜力生物标志物［1-4］。已有研究结果表明，炎症细胞因子的过量表达与肥胖和胰岛素抵抗的程度高度相关［5］，而miR-21 潜在靶向调节多种炎症细胞因子的表达及分泌［6-7］，但miR-21 的表达水平与腹型肥胖者糖代谢紊乱及糖尿病发病的关系及临床意义尚未见报道。本研究将探究腹型肥胖者外周血miR-21 表达与代谢紊乱及糖尿病发病风险的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2017年1月至2019年12月间于本院内分泌科收治的内分泌科诊断为初发2 型糖尿糖患者160 例，设为T2DM 组，年龄41～79 岁，平均年龄（52.29±14.03）岁，男104 例，女56 例。选取同期在本院体检的健康志愿者80 例，设为NC 组，年龄40～79 岁，平均年龄（52.33±14.15）岁，男49，女31 例。按照腰围身高比（＞0.5 的腹型肥胖标准）将T2DM组与NC 组对象细化亚组，即T2DM 腹型肥胖组（T2DM-AO 组=80 例），T2DM 非腹型肥胖组（T2DM-NAO 组=80 例），NC 腹型肥胖组（NC-AO组=40 例），NC 非腹型肥胖组（NC-NAO 组=40 例）。

入选标准：①符合美国糖尿病学会（ADA）2016年制定的糖尿病诊断标准［8］，初发糖尿病；②腰围/身高比大于0.50（腹型肥胖的判定标准［9］）；③入院后24 小时内留取静脉血及血清样本；④自愿参加本研究方案。排除标准：①有严重的肝、肾、心、肺等系统疾病、自身免疫性疾病或功能衰竭及严重感染者；②服用过糖尿病药物或接受过糖尿病治疗的患者；③拒绝配合研究者。本研究在实施前经本院伦理委员会审阅批准。

1.2 方法

1.2.1 常规指标测定

在空腹12 h 以上进行测定：身高、体重、腰围，计算体重指数（Body Mass Index，BMI）、腰围身高比（Waist to Height Ratio，WHtR）；采集肘静脉血进行肝功能、血常规、甘油三酯（Triglyceride，TG）、空腹血糖（Fasting Blood Glucose，FBG）、糖化血红蛋白（Glycosylated Hemoglobin，GHbA1C）的测定。

1.2.2 外周血miR-21 表达的检测

使用RNA 提取试剂盒（RN46-血清/血浆microRNA 快速提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司）对采集的3 mL 肘静脉血进行处理。对提取出的RNA，使用miRNA cDNA 第一链合成试剂盒（miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit，购自北京百奥莱博科技有限公司）反转录合成cDNA。将cDNA 作为模板，荧光定量PCR 方法用以检测表达量，引物序列miR-21（上游引物5′-GATCCTAGCATCGTAGCTA-3′，下游引物为试剂盒自带），U6（上游引物5′-TAGATCGTATAGCTAT-3′，下游引物5′-TAAGCTAGCTAGCTAGCTA-3′）。扩增程序按照95℃3min 循环1 次，95℃15 s-60℃30 s 循环40 次设置，使用miRNA 荧光定量PCR 检测调剂盒（miRNA Real-Time PCR Assay kit，购自北京博凌科为生物科技有限公司）。上机后得到相关曲线和循环阈值（Ct），U6 作为内参，2-△△Ct法计算miR-21 的相对表达水平。

1.2.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件进行数据统计分析，计量资料以（±s）表示，两组间比较用t检验，采用多元Logistic 回归分析方法进行多因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。对于Logistic 回归模型建立ROC 曲线的线下面积AUC 表征预测性能。

2 结果

2.1 两组一般资料的比较

T2DM 组患者与NC 组年龄、腰围、WHtR、BMI、ALT 等指标比较无统计学意义（P＞0.05），T2DM 组TG、FBG、GHbA1C、miR-21 明显高于NC组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 糖尿病单因素差异分析

各亚组年龄、ALT 比较无统计学意义（P＞0.05），T2DM-AO 组与NC-AO 组腰围、WHtR、BMI 均明显高于T2DM-NAO 组与NC-NAO 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；T2DM-AO 组TG、FBG、GHbA1C、miR-21 指标最高，T2DM-NAO 组次之，与NC-AO组及NC-NAO 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 糖尿病发病风险的多因素分析

利用资料数据中的BMI、腰围身高比（WHtR）、血清谷丙转氨酶（ALT）、甘油三酯（TG）和外周血miR-21 相对表达量作为自变量，糖尿病是否发病为应变量，对腹型肥胖糖尿病组及单纯腹型肥胖组数据进行多元Logistic 回归分析。miR-21 相对表达量增高是单纯腹型肥胖病人糖尿病发病的最显著的风险因素，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图1。

表1 两组基本临床资料比较（±s）Table 1 Comparison of general information of 2 groups（±s）

表1 两组基本临床资料比较（±s）Table 1 Comparison of general information of 2 groups（±s）

指标年龄（岁）腰围（cm）WHtR BMI（kg/m2）ALT（U/L）TG（mmol/L）FBG（mmol/L）GHbA1C（%）miR-21 T2DM 组（n=160）52.29±14.03 85.64±5.71 0.52±0.04 24.23±2.99 22.23±3.31 1.86±1.07 8.06±2.28 9.08±2.50 10.25±3.72 NC 组（n=80）52.33±14.15 86.29±5.54 0.51±0.04 24.46±2.75 21.61±1.76 1.23±0.59 5.19±0.37 5.16±0.47 2.67±1.45 t 值0.0208 0.8395 1.8257 0.5767 1.5671 4.9034 11.1741 13.8885 17.5555 P 值0.9835 0.4020 0.0691 0.5647 0.1184＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

表2 糖尿病单因素差异分析（±s）Table 2 Analysis of Single Factor Differences in Diabetes（±s）

表2 糖尿病单因素差异分析（±s）Table 2 Analysis of Single Factor Differences in Diabetes（±s）

注：与NC-AO 组比较，aP＜0.05，与NC-NAO 比较bP＜0.05，与T2DM-NAO 组比较，cP＜0.05。

指标年龄（岁）腰围（cm）WHtR BMI（kg/m2）ALT（U/L）TG（mmol/L）FBG mmol/L）GHbA1C（%）miR-21 T2DM 组T2DM-AO（n=80）53.27±15.72 92.23±6.84bc 0.56±0.06bc 26.37±3.01bc 22.41±3.72 1.98±1.12ab 8.37±2.11abc 9.41±2.51abc 12.82±4.97abc T2DM-NAO（n=80）51.30±12.55 79.06±4.82 0.48±0.03 22.08±2.97 22.05±2.58 1.73±1.01b 7.75±2.46ab 8.76±2.49ab 7.68±3.01ab NC 组NC-AO（n=40）52.08±13.98 94.35±6.73 0.55±0.05 25.91±2.59 22.15±1.81 1.42±0.72 5.36±0.42 5.53±0.45 3.42±1.75b NC-NAO（n=40）52.57±14.32 78.24±4.91 0.47±0.03 23.01±2.84 21.08±1.73 1.05±0.46 5.02±0.35 4.79±0.48 1.92±1.12 F 值0.26 116.03 62.75 35.89 2.04 9.73 42.72 66.53 115.58 P 值0.8508＜0.05＜0.05＜0.05 0.1094＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

表3 糖尿病发病风险的Logistic 回归分析Table 3 Logistic regression analysis of diabetes risk

图1 miR-21 相对表达量增高与糖尿病发病的ROC 曲线Figure 1 ROC curve of increased relative expression of miR-21 and the onset of diabetes

3 讨论

随着生活水平的提高，我国的肥胖发生率在迅速增长，肥胖可导致代谢异常和各种疾病，包括糖尿病、高血脂、高血压、冠心病、胰腺炎和肿瘤等［10］。在中国，与肥胖相关的2 型糖尿病的发生率在近10年中增加了50%［11］。而糖尿病无法治愈，必须通过健康教育、改变饮食以及生活习惯，甚至长期注射药物等手段进行治疗。肥胖是发生糖尿病（主要是2 型糖尿病）的重要危险因素之一。在长期肥胖人群中，糖尿病的患病率明显增加，可高达普通人群的5 倍以上。另一方面，2 型糖尿病人中的80%都是肥胖者［12］。发生肥胖的时间越长，糖尿病发生的风险越高。腹部型肥胖者糖尿病发生的风险远大于臀部型肥胖者，腰围/臀围的比值具有显著的意义［13］。2 型糖尿病是内分泌代谢疾病，其主要表现是持续性的血糖升高，2 型糖尿病者的胰岛素抵抗与内脏脂肪含量存在相关关系［14-15］。袁姿等［16］的研究显示腹型肥胖者2 型糖尿病的发生发展与IL-6 等炎症细胞因子密切相关，IL-6 对肝脏的调节作用以及IL-6 本身对胰岛细胞的毒性影响是可能的作用原因。

MicroRNA 是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长度约为20～25 个核苷酸，microRNA 参与各种各样的调节途径，包括发育、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等［17］。寻找疾病相关的microRNA 并发进行发病机理研究，应用于疾病的诊断和治疗，日益受到研究者的关注。已有研究报道，miR-21 靶向JAK2/STAT3 通路，发挥抑制炎症反应的作用［18］，miR-21 的主要生物学作用是抑制炎症反应，miR-21 表达量增多是机体自我保护性的代偿调节炎症反应和介导调节炎症细胞因子的释放［19］。扎西吉［20］等发现miR-21 可能通过影响Th17/Treg 平衡，调控IL-10、IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β 等细胞因子水平，促进自身免疫性肝病进展。

腹型肥胖者外周血miR-21 表达对其糖代谢紊乱及糖尿病的发生具有一定的预测作用，鉴于糖尿病至今没有治愈的方法，早发现、早诊断成为减缓糖尿病切实可行手段，腹型肥胖患者外周血miR-21 监测对于糖尿病早期筛查具有重要意义。同时在检验监测到腹型肥胖者外周血miR-21 表达量异常时，及早评估、及早干预，有望大大降低腹型肥胖者的糖尿病发生风险。