小儿视网膜母细胞瘤VEGF、Cyclin D1及E-Cadherin表达及与组织病理特征的关系
2020-12-05汪岭马雪莲王启明
汪岭 马雪莲 王启明
视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）为儿童发病率较高的一类眼内恶性肿瘤，不仅对患儿视力造成严重影响，更危及患儿的生命安全［1］。肿瘤血管新生和细胞外基质降解为肿瘤浸润转移过程中的关键因素，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）为已知的最强促血管形成因子之一，在恶性肿瘤发生发展中具有重要作用［2］。细胞周期调节蛋白D1（Cell cycle regulatory protein D1，Cyclin D1）参与了细胞周期G1/S 期转换，与多种肿瘤的发生发展密切相关［3］。上皮钙黏蛋白（Epithelial cadherin，E-Cadherin）阳性表达具有抑制肿瘤细胞侵袭转移的功能，并与多种肿瘤肿瘤浸润、临床分期及淋巴结转移密切相关［4］。目前，对于VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 在RB 患儿中联合检测的研究尚不多见，RB 患儿肿瘤组织VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表达检测对于RB 患儿的诊断、评估和预后分析可能存在显著价值。故本研究对RB 患儿VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表达及与组织病理特征的关系进行了研究，具体如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取本院2017年1月至2019年1月收集的55例小儿RB 组织样本，纳入标准：①均为单眼发病；②均经病理学检查确诊；③均征得患儿家属同意并签署知情同意责任书。排除标准：①合并其他眼部疾病者；②临床资料缺失者；③依从性差及无法配合完成此研究者；④合并其他严重疾病者。患儿年龄为5 个月至8 岁，平均（2.8±0.6）岁，男30例，女25 例，左眼29 例，右眼25 例，分化35 例，未分化25 例；侵犯神经36 例，未侵犯神经24 例；临床分期眼内生长期7 例、眼内压增高期28 例、眼外转移期20 例；病理分期R0 期（肿瘤细胞不呈菊花团状排列）5 例、R1（仅少数肿瘤细胞呈菊花团状排列）期27 例、R2 期（多数肿瘤细胞呈菊花团状排列）23 例。并取55 例患儿瘤旁正常视网膜组织作为对照。本研究取得医学伦理委员会批准通过。
1.2 方法
1.2.1 临床病理特征统计
统计所有RB 组织对应患儿的性别、年龄、分化情况、临床分期、视神经侵犯程度、病理分期等资料。
1.2.2 免疫组织化学法染色
免疫组化染色法检测VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表达，取肿瘤组织及癌旁正常视网膜组织常规石蜡包埋，4 μm 连续切片，常规脱水，抗原修复。加入一抗和二抗，37℃孵育40 min。DAB 显色30 s，苏木精复染，封片显微镜下观察。VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 染色结果表现为细胞质或细胞核中染色为棕黄色颗粒。结果判读［5］：阳性细胞数评分随机选取5 个高倍镜视野，视野内阳性细胞数百分比≤5%为阴性（-），6%～25%为弱阳性（+），26%～50%为阳性（++），＞50%为强阳性（+++）。
1.3 统计学分析
采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ2检验；Spearman 检验分析各指标相关性，Cox 回归模型分析各指标与RB 患儿预后的关系。以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 正常视网膜组织与RB 组织VEGF、Cyclin D1及E-Cadherin 表达情况比较
免疫组化染色结果显示，RB组织中VEGF、Cyclin D1 表达阳性率均显著高于正常视网膜组织（高表达），E-Cadherin 表达显著低于正常视网膜组织（低表达），差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1和表1。
图1 RB 组织VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表达免疫组化染色（SP，×200）Figure 1 Immunohistochemical staining of VEGF，Cyclin D1 and E-Cadherin expression in RB tissue（SP，×200）
表1 正常视网膜组织与RB 组织VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表达情况比较［n（%）］Table 1 Comparison of VEGF，Cyclin D1 and E-Cadherin expression between normal retinal tissue and RB tissue［n（%）］
2.2 RB 组织VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表达相关性分析
VEGF、Cyclin D1 之间存在正相关性，差异有统计学意义（P＜0.05），VEGF、Cyclin D1 均与E-Cadherin 之间存在负相关性，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。
表2 RB 组织VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表达相关性分析Table 2 Correlation analysis of VEGF，Cyclin D1 and E-Cadherin expression in RB tissue
2.3 RB 患儿VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表达与组织病理特征的关系
RB 患儿不同性别、年龄、眼别VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表达阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同分化情况、临床分期、病理分期、视神经侵犯程度RB 患儿VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表达阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。
2.4 Cox 回归多因素生存分析
临床分期越高、神经侵犯程度越高、VEGF、Cyclin D1 阳性高表达及E-Cadherin 低表达阳性为影响患者生存的不良因素（P＜0.05）。见表4。
3 讨论
RB 具有生长速度快、恶性程度高的特点，主要来源于光感受器前体细胞，多具有一定的家族遗传倾向，容易发生颅内及远处转移，危及患儿生命［6］。视网膜母细胞瘤多表现为结膜内水肿、充血、角膜水肿、玻璃体混浊、虹膜新生血管、眼压升高及斜视等，但其具体的机制目前尚未完全明确［7］。研究认为［8］，原癌基因和抑癌基因表达平衡失调及转录调控异常为肿瘤发生、发展的分子机制。
本研究结果提示VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 在RB 病理进程中具有重要作用。视网膜母细胞瘤与多数实体瘤一样，肿瘤发生发展需要通过血管、淋巴管向远处转移，也需要新生血管形成二维肿瘤组织提供充足的营养物质。VEGF 为强促血管生成因子，也是肿瘤血管新生的主要促进因子，是多种实体瘤发生发展的关键因子［9］。Cyclin D1 为反映细胞周期变化的蛋白，为细胞周期的正向调控因子，Cyclin D1 表达异常上调可导致组织细胞无序性生长增加，从而导致肿瘤的发生。近年来，对于Cyclin D1 在肿瘤发生发展中的作用受到广泛重视，在多种恶性肿瘤组织中都检测到Cyclin D1 的过度表达［10］。本研究中，在RB 组织中Cyclin D1 表达相较于癌旁正常视网膜组织表达阳性率明显升高。研究表明，Cyclin D1 在食管癌、前列腺癌等疾病过程中发挥重要作用，并与分化程度、组织学类型等密切相关［11-12］。
表3 RB 患儿VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表达与组织病理特征的关系［n（%）］Table 3 The relationship between the expression of VEGF，Cyclin D1 and E-Cadherin and histopathological characteristics in children with RB［n（%）］
表4 Cox 回归多因素生存分析Table 4 Cox regression multivariate survival analysis
E-Cadherin 为膜整合糖蛋白家族的一类，为钙离子依赖性正常细胞-细胞黏附的主要介质。研究证实［13-14］，E-Cadherin 低表达可促进癌细胞侵袭、分化和转移，是机体重要的抗肿瘤侵袭分子之一。另有研究指出［15］，E-Cadherin 表达水平与宫颈癌的侵犯血管、病理分期等密切相关，E-Cadherin表达越低，肿瘤侵袭更深，远处转移更广。本研究结果显示，VEGF、Cyclin D1 之间存在正相关性，VEGF、Cyclin D1 分别与E-Cadherin 存在负相关性，但其具体机制仍有待进一步研究。本研究推测：RB 恶性程度越高，肿瘤新生血管也更加丰富，其生长也更加迅速，诱导新生血管形成的能力提高，促使VEGF 和Cyclin D1 升高，随着肿瘤发展，机体抗肿瘤能力逐渐降低，E-Cadherin 表达也随之降低。这提示VEGF、Cyclin D1 表达越高及E-Cadherin 表达越低，RB 患儿预后越差；VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 可作为RB 患儿预后评估的有效监测指标。在接下来的研究中，本研究将着重针对VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 影响RB 发生发展及三指标之间存在的相互关系的分子生物学机制进行研究，以为RB患儿的临床诊疗和预后评估提供参考。
综上所述，VEGF、Cyclin D1 阳性表达越高、E-Cadherin 阳性表达越低，小儿RB 肿瘤恶性程度越高、预后越差，检测VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表达有助于RB 患儿病情评估。
