缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作患者血清miR-23b-3p水平变化的比较研究

樊春荔，何燕娟(常州市第一人民医院，江苏常州 210002)

中风是当今世界危害人类生命安全的重要因素。在中国，中风已成为导致人类死亡和残疾的主要原因[1-2]。缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)是卒中最常见的亚型，是由于机体动脉硬化或血栓阻塞血管，继而表现为神经系统症状的突然发作。短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack,TIA)也被称为“小中风”，其起源与IS相同，症状类似，但持续时间相对较短（一般不超过24h）[3]。目前，IS及TIA患者确诊主要依靠神经影像学技术，但此类检查对急性重症患者动态观察有一定的局限性，而且难以鉴别早期IS和TIA及其他类似疾病，故具有一定的局限性。现有的与缺血性脑损伤相关的临床生化指标特异性较低，缺乏足够的预测能力。故急需一种新方法解决当今临床面临的问题。

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类内源性高度保守的非编码单链小RNA，在转录后水平调控基因表达[4]。已有研究证实[5-6]，多种miRNAs可在中枢神经系统中表达，可能参与神经系统疾病的发生、发展。miRNAs与心脑血管疾病的发生发展关系密切，且在血清或血浆标本中稳定存在并能长期超低温储存[7-8]。近年来，血清或血浆miRNAs作为诊断脑血管疾病的重要生物标志物受到了广泛关注。目前，有关IS患者及TIA患者血清miRNA表达变化及系统研究较少。本课题组前期低密度芯片分析显示，IS患者血清miR-23b-3p的表达明显上调。因此，探讨IS和TIA患者的血清miR-23b-3p水平变化，评估血清miR-23b-3p水平与疾病发生的关系，可能为临床IS和TIA患者的病情评估与判断提供新的途径和方法。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究招募了2017年8月～2019年4月常州市第一人民医院神经内科收治的156例IS患者及71例TIA患者作为观察组。IS患者通过头颅电子计算机断层扫描(computed tomography,CT)和磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)等技术确诊，排除标准：①有出血性梗死史；②有外周动脉阻塞性疾病；③有慢性肝肾疾病；④伴有原发性/转移性肿瘤或其他恶性疾病者。通过美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)对IS患者进行分级，轻度(NIHSS＜6,n=65)、中度(6＜NIHSS＜13,n=74)及重度(NIHSS＞13,n=17)。TIA患者入选符合2009年AHA/ASA提出的TIA诊断标准[3]，排除标准：①经头颅CT或MRI证实有新发梗死病灶或有颅内出血者；②伴有严重感染者；③伴有其他神经系统疾病以及严重的肝肾功能不全者；④有甲状腺功能异常、恶性肿瘤、血液系统疾病及全身免疫性疾病的患者。健康对照组招募85例健康体检者。两组之间性别、年龄匹配，具有可比性。所有患者和对照组均自愿签订知情同意书，且得到伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 高速离心机购自上海医疗器械集团有限公司，检测仪器为美国Applied Biosystems公司7300qRT-PCR仪，美国贝克曼AU5800全自动生化分析仪，TaqMan探针购自美国Applied Biosystem公司。血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)水平测定采用英国Randox公司试剂盒，高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平测定采用日本第一化学株式会社试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 标本的采集与处理：采用真空采血管收集所有研究对象禁食12 h以上的静脉血液标本约3～5ml，IS患者及TIA患者均于入院时即刻采集，4℃下12 000 g离心5min去除血细胞收集血清，并将血清标本置于-80℃冰箱保存。所有血液标本均取得本人的知情同意，且得到医院伦理委员会批准。

1.3.2 血清miR-23b-3p水平测定：采用实时荧光定量PCR(quantitative reverse-transcription PCR,qRTPCR)技术检测血清miR-23b-3p水平，结果以循环值(threshold cycle，Ct)表示，miRNA表达量均采用相对定量法进行计算，以MIR2911探针作为外参，待测样本miRNA的相对变化倍数△Ct=△CtmiRNAs-△Ct外参。

1.4 统计学分析 用SPSS20.0软件进行数据分析。以Kolmogorov-Smirnov法检验各组的分布特征。其中正态分布数据采用均数±标准差(±s)表示，偏态数据需经对数转换后再行统计学分析，采用中位数(第25～75百分位数)表示。两组间比较采用两独立样本的t检验；多组间比较用单因素方差分析，方差齐时组间两两比较采用LSD-t检验，方差不齐时采用Tamhane'sT2检验。变量间相关性采用Spearman相关分析。ROC曲线分析计算血清miR-23b-3p判别疾病的曲线下面积(area under the curve,AUC)及 其95%置信区间(confidence interval,CI)。多元Logistic回归分析计算各指标对疾病预测的OR值和95% CI。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的基本临床信息 对IS患者、TIA患者及对照组的基本信息及血清生化指标进行分析，见表1。结果显示：三组研究对象间年龄（F=0.575,P=0.439）、性别(χ2=0.149,P=0.925)差异均无统计学意义；与对照组相比，IS及TIA患者的血清TG水平均显著升高(IS:t=3.224,P=0.049;TIA:t=3.857,P=0.021)，HDL-C水平明显 降低(IS:t=4.137,P＜0.001;TIA:t=5.481,P＜0.001)，差异均有统计学意义。

表1 研究对象的临床基本信息及血清生化指标

2.2 IS患者和TIA患者血清miR-23b-3p水平 分析IS组、TIA组及对照组的血清miR-23b-3p水平，见图1(A)。结果显示：IS组(t=4.517,P＜0.001)及TIA患者组(t=2.728,P＜0.001)血清miR-23b-3p水平均显著高于对照组，且IS组明显高于TIA患者组(t=3.364,P=0.043)，差异均有统计学意义。进一步分析不同严重程度IS患者的miR-23b-3p表达量，见图1(B)。结果显示：重度IS组miR-23b-3p水平明显高于中度IS组(t=1.212,P=0.034)和轻度IS组(t=4.931,P＜0.001)，中度IS组miR-23b-3p水平高于轻度IS组(t=2.199,P=0.009)，差异均有统计学意义。

图1 IS患者和TIA患者血清miR-23b-3p水平

2.3 血清miR-23b-3p水平的临床价值 相关性分析显示，IS患者血清miR-23b-3p水平与NIHSS评分呈正相关，差异有统计学意义(r=0.453,P＜0.001)；与患者TC，TG等水平无显著相关性。

ROC曲线分析显示，血清miR-23b-3p区分IS患者与健康对照者的AUC为0.817(95%CI:0.762～0.873,P＜0.001)；区分TIA患者与健康对照者的AUC为0.789(95%CI:0.716～0.861,P＜0.001)。

进一步多元Logistie回归分析，以IS，TIA和健康对照组为独立的三分类变量。单因素分析显示：以健康对照组作为参考类别，血清高miR-23b-3p水平与IS及TIA的发生相关；以TIA患者组作为参考类别，血清高miR-23b-3p水平仍与IS的发生相关。多因素分析显示：以健康对照组作为参考类别，在校正了年龄、性别、TC及TG水平的影响后，血清miR-23b-3p水平的升高与IS及TIA的发生仍相关；以TIA患者组作为参考类别，血清高miR-23b-3p水平仍可区分IS的发生，见表2。

表2 血清miR-23b-3p对IS及TIA的预测与区分价值

3 讨论

miRNAs的表达分布具有高度的组织和细胞特异性，且参与多种生物进程与疾病发展[9]。目前，已发现多种miRNAs参与神经系统疾病的起源与发展[6,10-12]。已有研究表明多种细胞可以主动或被动地释放循环miRNAs[13]。多个研究小组已对IS患者循环miRNAs的表达模式进行研究，强调了miRNAs介导的脑缺血调节网络，提示miRNAs可能成为IS检测的潜在生物标志物[14-15]。在前期研究中，我们通过低密度芯片技术筛选出血清miR-23b-3p，进一步通过qRT-PCR技术检测其在IS患者和TIA患者中的特异性表达。经过多种统计分析发现，IS患者和TIA患者血清miR-23b-3p表达水平显著升高，提示miRNAs可能参与缺血性脑血管病的发生、发展。

有研究发现[16]，miR-23b-3p参与缺血缺氧诱导的神经细胞凋亡，其表达上调可减轻被诱导的神经元细胞凋亡。这些发现为miR-23b-3p参与缺血性脑损伤提供了支持，为进一步研究其在缺血性脑血管病中的临床意义提供依据。本研究发现，NIHSS评分越高的IS患者血清中miR-23b-3p水平升高越显著。由此，我们推测血清miRNA的改变可能来源于大脑皮层或海马区神经元的缺氧/缺血损伤，IS患者血清miRNA水平的升高可能是加重神经功能缺损的血清学反应。

TIA是一种可逆的神经功能障碍且无急性组织梗死的局灶性暂时性脑缺血发作，其临床表现与IS早期非常相似。TIA患者后期中风风险将显著增高，通常将其作为中风前兆。因此，有效预测TIA的发生，区分TIA和初级卒中，有助于早期预防卒中及其后遗症的发生。多项研究发现[17]啮齿类动物短暂性大脑中动脉阻塞后血液miRNAs表达显著改变，提示循环miRNAs在脑缺血早期具有反应性，可作为轻度脑缺血损伤的敏感指标。然而，特异性miRNA血清水平变化在TIA患者中的潜在临床应用尚不清楚。在本研究中，TIA及IS患者血清miR-23b-3p水平均显著升高(P＜0.001)，且IS患者组高于TIA患者组(P=0.043)；IS患者血清miR-23b-3p水平与NIHSS评分呈正相关(P＜0.001)。说明高水平的血清miR-23b-3p可能有助于IS的危险分层和TIA的早期鉴别，为疾病预测和鉴别诊断提供了新思路。由此可见，血清miR-23b-3p有望成为IS和TIA预测和鉴别的潜在生物标志物，对评估TIA后神经功能缺损的严重程度及随后的卒中风险有重要意义。