系统性红斑狼疮患者血清抗核抗体免疫荧光核型与特异性抗体谱的相关分析

晁亚妮，盖玉萍，赵咏梅，何华月，白文栋，邹红云

（新疆军区总医院a.检验科；b.血液科，乌鲁木齐 830000）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种由免疫介导的、多种炎症因子共同参与的自身免疫性疾病，其病因和发病机制至今尚无明确定论。多种自身抗体的产生是SLE的重要病理过程之一，自身抗体的产生及免疫复合物的形成并沉积可造成多个器官受累，这类抗体通常总称为抗核抗体（antinuclear antibodies,ANA），ANA检测在SLE等自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断中具有重要意义[1]。临床上常采用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence,IIF）作为检测ANA总抗体的筛查实验，IIF-ANA检测基质含有较完整的细胞成分抗原谱，能够针对细胞中的抗原出现特异性的荧光核型，检测灵敏度较高，但IIF-ANA不能提示具体的靶抗原，特异度低。线性免疫印迹（line-blot immunoassay-LIA）法是临床中应用较为广泛的一种特异性抗体分型确认实验，特异度高，一次实验可以同时检测多种特异性自身抗体，但目前能检出的特异性抗体种类还十分有限。在临床工作中常常出现ANA免疫荧光筛查与线性免疫印迹检测结果不相符的情况，为此，本研究通过回顾性分析263例SLE患者ANA免疫荧光筛查与特异性抗核抗体谱（antinuclear antibody profile,ANAs）检测结果，探讨二者之间的相关性，以期为SLE的准确诊断和及时治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2015年1月～2018年12月在本院住院确诊为SLE患者263例，其中男性41例，女性222例，年龄15～85岁，排除其他并发的自身免疫性疾病及肿瘤。所有患者诊断标准均符合1997年美国风湿病学会修订的SLE分类诊断标准。收集患者性别、年龄、民族、ANA免疫荧光（IIF-ANA）筛查和特异性抗核抗体谱线性免疫印迹（LIA-ANAs）检测结果等信息。

1.2 试剂与仪器 试剂均购自欧蒙（杭州）医学实验诊断有限公司；Nikon 80i荧光显微镜，EURO Blot MasterⅡ全自动免疫印迹仪，佳能Lide100扫描仪。

1.3 方法

1.3.1 ANA检测：采用间接免疫荧光法（IIF），以猴肝片及Hep-2细胞作为抗原基质进行检测。检测结果判读由经验丰富的检验医师在免疫荧光显微镜下观察HEp-2细胞的荧光染色情况，若无特异性绿色荧光则为阴性，若特异性荧光较强则为阳性，并报告相应的免疫荧光模型。阳性血清按照1∶100，1∶320，1∶1 000，1∶3 200和1∶10 000稀释梯度确定抗体最终滴度。

1.3.2 ANA谱（ANAs）检测：采用线性免疫印迹法（LIA）检测15种特异性IgG类抗体：抗核糖核蛋白（ribonucleoprotein,RNP）抗体、抗史密斯（Smith,Sm）抗体、抗舍格伦综合征抗原A（sjogren’s syndrome antigen A,SSA）抗体、抗舍格伦综合征抗原B（sjogren’s syndrome antigen B，SSB）抗体、抗Ro-52（Ro-52）抗体、抗双链DNA(double stranded DNA，dsDNA)抗体、抗核小体（nucleosome,NUC）抗体、抗组蛋白(Histones,HI)抗体、抗硬皮病-70(scleroderma-70，Scl-70)抗体、抗多发性肌炎/硬皮病(polymyositis-scleroderma,PM-Scl)抗体、抗核糖体P蛋白(ribosome P-protein,RIB)抗体、抗组氨酰tRNA合成酶(Jo-1)抗体、抗线粒体抗体-M2型（anti-mitochondrial antibody-M2,AMA-M2）、抗增殖细胞核抗原抗体（proliferating-cell nuclear antigen antibody,PCNA）和抗着丝点蛋白B（centromere protein B,CENP-B）抗体。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计数资料以[n（%）]表示，多组间的比较采用R×C表χ2检验；配对资料的比较采用McNemarχ2检验，一致性分析采用Kappa检验，一致性程度根据Kappa值范围进行判断：Kappa＜ 0.4，两者一致性较差；0.75＞Kappa≥0.4，为一致性一般；Kappa≥0.75，为一致性较好。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 IIF-ANA与LIA-ANAs检测结果比较 见表1。263例SLE患者血清IIF-ANA检测阳性率为94.29%（248/263），LIA-ANAs检测阳性率为89.73%（236/263），二者差异无统计学意义（χ2=3.726，P＞ 0.05）；IIF-ANA和LIA-ANAs检测结果的总体一致率为89.35%（235/263）；对两种方法检测结果符合率进行统计学分析（配对设计的McNemarχ2检验）结果表明，两种方法检测结果不一致，差异具有统计学意义（χ2=2.63，P＜ 0.05）；一致性分析结果提示两种检测方法一致性较差，Kappa=0.281，＜ 0.4，P＜ 0.05。

表1 IIF-ANA和LIA-ANAs检测结果比较[n (%)]

2.2 IIF-ANA阳性病例中ANA抗体滴度分布及ANAs阳性率 见表2。IIF-ANA阳性病例中，随着ANA滴度增加，LIA-ANAs阳性率增高；不同ANA滴度组间LIA-ANAs阳性率差异具有统计学意义（P＜ 0.05），进一步两两比较结果表明：滴度1:1 000病例组LIA-ANAs阳性率显著高于滴度1:100病例组（χ2=11.65，P＜ 0.05）；滴度≥1∶3 200病例组阳性率显著高于滴度1:100病例组（χ2=12.82，P＜ 0.05），也显著高于滴度1:320病例组（Fisher精确检验P＜ 0.05）。

表2 IIF-ANA阳性病例抗体滴度分布及LIA-ANAs阳性率

2.3 SLE患者ANA 免疫荧光核型与ANAs特异性抗体分布情况248例IIF-ANA阳性患者荧光核型主要包括核颗粒型（68.55%，170/248）、核均质型（32.26%，80/248）、胞浆颗粒型（13.31%，33/248）、核仁型（4.84%，12/248）和着丝点型（2.82%，7/248）；236例LIA-ANA阳性患者ANAs检出率分别为：SS-A 66.95%（158/236），ds-DNA 55.51%(131/236)，Ro-52 52.12%（123/236），RNP 44.92%（106/236），NUC 33.90%（80/236），HI 33.05%（78/236），RIB 26.27%（62/236），Sm 23.73%（56/236），SS-B 15.25%（36/236）。

对IIF与LIA同时为阳性的228例患者ANA核型与ANAs特异性抗体结果对比分析，见表3。不同的ANA荧光核型中检出的特异性抗体种类有所不同，核颗粒型以ds-DNA和抗RNP抗体为主，核均质型以ds-DNA和抗核小体抗体为主，胞浆颗粒型以抗RNP和ds-DNA抗体为主，核仁型以ds-DNA抗体为主，着丝点核型主要为CENP-B抗体，阳性率为100%。

3 讨论

自1957年Holborow及Friou等首先以啮齿动物组织冷冻切片为抗原底物，应用间接免疫荧光技术（IIF）检测ANA以来，临床上常规检测ANA一直沿用IIF法作为ANA总抗体的筛查实验，以Hep-2细胞为基质的IIF-ANA检测是自身免疫性疾病重要的筛查实验[2-3]。IIF-ANA检测易于观察荧光滴度和特征性免疫荧光核型。但IIF-ANA检测结果受主观判断影响较大，荧光核型对特异性自身抗体的提示作用也较为局限。LIA-ANAs检测操作简便，具有较高的灵敏度和特异度，因此，作为ANA检测“金标准”的IIF方法受到严峻的挑战[4]。

本研究结果表明IIF-ANA和LIA-ANAs两种方法在SLE患者检测阳性率无显著性统计学差异，二者总体符合率较高（为89.35%）,但是仍然存在IIF-ANA与LIA-ANAs检测结果不相符的情况。

表3 不同荧光核型中ANAs特异性抗体分布情况[n (%)]

对两种方法检测结果的符合率和结果一致性进行统计学分析，结果提示两种方法检测结果不一致，两种检测方法一致性较差，其原因主要是由于检测方法不同所致。IIF法玻片基质上覆盖的细胞成分抗原谱种类多，而LIA法检出的抗体种类有限，这可能是造成IIF阳性而LIA阴性的主要原因。而IIF阴性LIA阳性可能是由于LIA膜条条带所包被的抗原纯度和特异度较高，而IIF检测基质中抗原分布不均匀、含量少等因素所致[5]。例如，SS-A抗原在Hep-2细胞中含量少，在制作基质时容易漏出而无法检测[6]；也有报道SLE患者由于药物治疗或处于发病早期或者大量蛋白经尿液排出而出现IIF-ANA阴性报道[7]，本研究也进一步证实IIFANA阴性SLE病例的存在。

一般而言，免疫荧光抗体滴度越高,与疾病的相关性越强，对疾病的预示性越明确。本研究中IIF-ANA阳性的SLE患者具有不同的ANA抗体滴度水平，这可能与患者处于不同疾病病程或药物治疗等因素有关。随着ANA滴度增加，LIAANAs的阳性率也呈增高趋势，与已有报道结果一致[8]，其原因可能是由于ANA滴度越高，血清标本中ANA抗体含量和特异性抗体种类也越多，因此ANAs检出率越高。

本研究中SLE患者IIF-ANA荧光核型以核颗粒型最为多见（占68.55%），与既往报道较一致[9-11]。其次为核均质型（32.26%），而其他核型（胞浆颗粒型13.31%、核仁型4.84%、着丝点型2.82%）阳性人数较少，这与既往报道的结果有一定偏差[9-11]，可能是由于不同研究对象的疾病构成不同所致。

对SLE患者ANAs特异性抗体谱分析表明，ds-DNA,RNP和核小体抗体在SLE中检出阳性率较高，是SLE较为敏感和特异抗体，与近期刘卫霞等[12]研究结果一致。ds-DNA抗体在各种核型中（除着丝点型未检测到ds-DNA外）阳性率均较高，在核均质型中阳性率最高（为72.5%），表明ds-DNA抗体对SLE诊断最为敏感和特异，应作为SLE血清学筛查的首选指标,核均质型对于SLE诊断的提示作用较大。

Sm抗体对SLE诊断也具有较高特异度，但敏感度较低，本研究中Sm抗体在不同核型中的阳性率（8.33%～29.41%）均较低，与文献报道一致[12]。SS-A和Ro-52抗体是与舍格伦综合征密切相关的特异性抗体，在多种自身免疫病中出现频率都较高，本研究SLE病例中SS-A和Ro-52抗体的检测阳性率也较高，与既往文献中报道相一致[13-14]。

综上所述，在SLE实验诊断中，IIF法检测ANA具有全面性，LIA法检测ANA谱具有检测的特异性，ds-DNA，RNP和核小体抗体对SLE诊断价值较高，在IIF-ANA筛查的同时进行LIA-ANAs特异性抗体确认实验检测，两种方法互补，可避免仅单独采用一种方法检测导致的漏诊，提高检出率，为SLE的准确诊断和及时治疗提供有价值的参考依据。