类风湿性关节炎患者血清RA-CP，抗CCP抗体及RF检测对RA的实验诊断意义

陈建芸，廖海平，孙朝晖，李林海，张宏斌（南部战区总医院.检验科；.医学实验科,广州 510010）

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，在世界范围内的发病率约为1%[1]。针对瓜氨酸化蛋白的自身免疫性可能与RA的发病机制相关，因此，跟踪该自身免疫性路径（自身免疫性抗原）有望发现该疾病发病机理的更多证据。尽管在RA的实验室诊断和监测中，监测针对血清中的瓜氨酸化肽，尤其是抗环瓜氨酸多肽（CCP）的抗体是诊断RA的标准检测靶标，但很少有研究关注血清或血浆中瓜氨酸化蛋白测定对RA诊断的临床应用意义。本研究采用了一种新型的类风湿性关节炎特异性抗原瓜氨酸化蛋白（RA-CP）测定试剂盒，测定的标志物是一组类风湿性关节炎特异性的瓜氨酸化蛋白抗原，比较分析了RA患者血清中RA-CP与传统的国际指南靶标抗CCP抗体及RF的水平，对其临床的诊断价值进行了分析。

1 材料与方法

1.1 研究对象 RA组选择2019年3月至2019年5月在中国人民解放军南部战区总医院门诊及住院就诊的RA患者共103例，其中女性78例，男性25例，年龄17～86岁平均年龄52岁，诊断符合2010年ACR与欧洲风湿病学会（EULAR）联合修订的RA分类标准。健康对照组选择健康体检者共105例，女性48例，男性57例，年龄22～88岁，平均年龄50岁。疾病对照组选择系统性红斑狼疮（SLE）25例，痛风性关节炎14例，硬皮病12例，舍格伦综合征（SS）10例，骨关节炎（OA）5例，强制性脊柱炎（AS）5例。抽取被检者的早晨空腹静脉血3ml（不抗凝），离心收集血清，-80℃冻存待检。

1.2 主要试剂与仪器 RA-CP检测试剂盒（广州市雷德生物科技有限公司），抗CCP抗体检测试剂盒（德国欧蒙公司），RF检测试剂盒及特种蛋白仪（德国西门子公司）。Spectramax M3多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

1.3 方法

1.3.1 测定方法：血清RA-CP和抗CCP抗体测定采用ELISA方法，血清RF测定采用特种蛋白仪及配套试剂。RA-CP和抗CCP抗体的检测按照试剂盒说明书和酶标仪的操作说明书进行，采用A450nm和A630nm双波长读取吸光度A值，测定结果根据试剂盒说明书提供的参考值计算样本的吸光度比值（即样本吸光度值AS与临界对照吸光度值ACO的比值，AS/ACO），AS/ACO比值等于1浓度计为1个单位（≥1为阳性）。RF测定结果根据定标曲线进行定量。

1.3.2 结果计算：分别计算RA-CP，抗CCP抗体和RF对RA诊断的敏感度、特异度、阳性似然比和阴性似然比。用GraphPad prism 7.0软件绘制受试者工作特征曲线（ROC曲线）并计算曲线下面积（AUC）。

1.4 统计学分析 实验数据采用SPSS24.0进行统计学分析，非正态分布计量资料用中位数和四分位数描述，配对样本的非参数检验采用McNemar检验。不同检测指标对RA诊断的应用价值用ROC曲线进行评估。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RA-CP对不同血清类型RA的检出率 根据抗CCP抗体和RF的检测结果将RA患者分为四种血清类型，分别为抗CCP抗体阳性/RF阳性RA、抗CCP抗体阳性/RF阴性RA、抗CCP抗体阴性/RF阳性RA和抗CCP抗体阴性/RF阴性RA。RA-CP在四种血清类型RA中的检出率分别为100.0%（57/57），40.0%（4/10），100.0%（15/15），19.0%（4/21）。在36例抗CCP抗体阴性的RA患者中，19例RA-CP检测为阳性，检出率为52.8%。

2.2 RA-CP检测对RA诊断的效能 RA组的RA-CP浓度水平中位数（四分位间距）为4.51（1.80～7.49）单位，高于其他疾病组的0.53（0.40～0.76）单位和健康对照组的0.52（0.35～0.69）单位，见图1。RA-CP在RA组、其他疾病组和健康对照组中的阳性检出率分别为77.7%，8.5%和2.0%，在RA组的阳性检出率高于其他疾病组和健康对照组。

图1 不同类型样本组RA-CP浓度比较

2.3 血清中RA-CP，抗CCP抗体、RF的比较 三种指标的ROC曲线见图2。RA-CP，抗CCP抗体、RF检测对RA诊断的曲线下面积分别为0.854（95%CI：0.797～0.911），0.820（95%CI：0.760～0.879），0.812（95%CI：0.754～0.871），敏感度分别为77.7%，65.0%，69.9%，见表1。特异度分别为95.5%，97.2%，89.2%。采用配对设计的样本率比较的McNemar检验显示，RA-CP在RA患者血清中的敏感度高于抗CCP抗体和RF，差异具有统计学意义（P=0.015，0.008，均P＜0.05）。单指标中，抗CCP抗体的特异度和阳性似然比最高，分别为97.2%和23.2；RA-CP的敏感度最高，阴性似然比最低，分别为77.7%和0.234（见表1）。

表1 三种指标单独和联合检测诊断RA效能的比较

三种指标中的两个或三个进行组合分析诊断的敏感度和特异度结果显示：RA-CP与抗CCP抗体两者的组合检测能提高RA诊断的敏感度，与RF两者或三者组合检测的特异度均会下降。RA-CP和抗CCP抗体组合的特异度和敏感度均高于或等于其它组合，分别为93.8%和83.5%。

图2 RA-CP，抗CCP抗体、RF用于RA诊断的ROC曲线

3 讨论

抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）被认为是RA最重要的有诊断意义的生物标记物，也是多年来RA最热门的研究方向。SCHELLEKENS等[2]和GIRBAL-NEUHAUSER等[3]分别于1998年和1999年证实瓜氨酸残基是RA特异性的抗聚丝蛋白抗体（AFA）所识别的主要抗原表位。DESPRES等发现的Sa抗原后来被研究证实为瓜氨酸化的波形蛋白，巨噬细胞内含有Sa抗原，当滑膜炎时会有大量的巨噬细胞聚集，巨噬细胞活化后可向细胞外分泌瓜氨酸化的波形蛋白[4-5]。研究发现抗瓜氨酸化蛋白的抗体可由炎症关节局部的B细胞产生，由此推断关节内可能存在瓜氨酸化抗原[6]。催化蛋白内精氨酸转化为瓜氨酸的酶-肽酰精氨酸脱亚氨基酶（PAD），存在于滑膜组织等多种组织和细胞中，因此关节局部可以产生瓜氨酸化蛋白。瓜氨酸化的纤维蛋白α链和β链被证实存在于滑膜内，而且被AFA识别[7]，这说明瓜氨酸化的纤维蛋白在RA的发病机制中可能发挥着重要的作用。近年来人们利用PAD酶在体外使蛋白瓜氨酸化或合成含有瓜氨酸多肽的方法先后发现了多种RA中可能存在的瓜氨酸化抗原，包括瓜氨酸化的Ⅱ型胶原、纤维连接蛋白、α-烯醇酶等[8]。

在2010年ACR与欧洲风湿病学会（EULAR）联合修订的RA分类标准中，ACPA和RF作为RA血清检测的指标被应用在指南中[9]。随着RA相关新的自身抗体不断发现，研究表明这些抗体对RA不但单独具有一定的诊断意义[10]，而且不同自身抗体组合检测可提高RA的临床诊断[11]。另外，ACPA和RF均属于自身抗体，文献报道抗CCP抗体和RF有显著的相关性[12]，二者应该属于同类性质的检测靶标。ACPA种类很多，包括抗角蛋白抗体（AKA）、AFA，抗核周因子抗体（APF）、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体（MCV）和抗CCP抗体等。抗CCP抗体检测产品目前已开发到第3代（CCP3），虽然CCP2和CCP3联合检测可以提高RA的诊断，但二者单独检测却无显著性差异[13]。因此以第二代CCP（CCP2）最为常见，虽然其特异度很高（95.3%），且具有较高的敏感度（71.6%）[14]，但仍有20%～30%的RA患者抗CCP2抗体检测结果为阴性。RF特异度差，在其他自身免疫性疾病、慢性感染性疾病中也常呈现阳性。除本研究外，目前没有文献报道对血清或血浆中类风湿性关节炎瓜氨酸化蛋白（RA-CP）测定的临床应用研究。

从检测原理上对比，RA-CP检测的是抗原，ACPA和RF均属于检测自身抗体，检测抗原更具有早发现和早诊断的技术优势。而且体内存在细胞免疫和体液免疫两条途径，部分自身免疫不产生抗体，这可能就是部分RA患者临床抗CCP抗体检测阴性的原因。本研究通过单项指标检测结果的分析同样显示，RA-CP对RA具有很好的诊断价值，与抗CCP抗体和RF相比，RA-CP可以检出超50%的抗CCP抗体阴性RA，极大地提高了血清阴性RA的检出率；而且通过联合检测分析，RA-CP与抗CCP抗体的组合检测可显著提高RA诊断的敏感度且保持高的特异度，联合诊断效能高于目前临床采用的抗CCP抗体与RF的组合。综上所述，RA-CP作为一种新的检测靶标，不仅与RA自身免疫的发病机制有着密切的相关性，而且可以作为RA临床诊断的新指标并有望成为更有效的辅助诊断指标。