全脑缺血-再灌注大鼠脑组织中DADLE浓度的测定*

谢慧，武钊，吴琳英，赵凯，李霜，欧阳斌，黄伟青

(1.广州医科大学附属第一医院药学部，广州 510120；2.昆明医科大学第一附属医院急诊科，昆明 650032；3.广州医科大学附属第一医院医务科，广州 510120；4.广州医科大学附属第一医院伦理委员会，广州 510120)

心脏骤停是急诊医学中常见的急症之一，因其居高不下的致死率及致残率给社会和家庭造成严重威胁。自2010年开始，国际心肺复苏指南着重强调对于自主循环恢复后的高级生命支持。其中，以脑复苏为重点的后期复苏阶段的处理，一直是国内外研究的热门课题。心脏骤停后引起的脑损害的病理生理主要是缺血缺氧性脑损伤以及自主循环恢复后的大脑缺血-再灌注损伤，近年研究发现，δ阿片受体激动剂可以诱导心肌冬眠和加强对缺血-再灌注损伤的保护作用。人工合成的δ阿片受体激动剂[d-丙氨酸2，d-亮氨酸5] 脑啡肽[(d-Ala2，d-Leu5)enkephalin，DADLE]在神经保护领域的作用也逐渐得到重视[1]。DADLE对全脑缺血经药物处理保护作用是否具有浓度相关性，笔者尚未见研究[2]。因此，笔者在本研究旨在建立一种快速、简便的大鼠脑组织液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定量检测方法，并应用于全脑缺血-再灌注模型大鼠脑组织中DADLE浓度的检测，为探索DADLE的脑组织保护作用与其浓度之间是否存在量效关系提供技术支持。

1 材料与方法

1.1仪器 岛津超高效液相色谱仪(Nexera UHPLC LC-30A)，菲罗门公司C18色谱柱(2.0 mm×50 mm，5 μm)。美国AB公司API 4000液相色谱串联三重四级杆质谱仪，AnaLyst 1.6数据处理系统)；Millipore Simplicity纯水机； BT25S电子天平(赛多利斯仪器公司，感量：0.01mg)；湘仪H1750台式高速离心机；冠森XH-D旋涡混合器；容声BCD-229S/EA电冰箱。

1.2样品与试剂 [d-丙氨酸2，d-亮氨酸5] 脑啡肽(DADLE)对照品(货号：D193335，纯度≥95%，多伦多研究化学品公司)；甲醇为色谱纯(色谱纯，Fisher公司)；甲酸(质谱级，Thermo Fisher公司)，实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3动物 清洁级SD大鼠，雄性，体质量220～250 g，购自南方医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SYXK(粤)2016-0167。于室内温度(23±1.5) ℃、相对湿度(65±10)%环境中，12 h日夜交替照明，正常饮食饮水适应性饲养1周后进行实验。

1.4色谱条件 色谱柱为Gemini C18(50 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A为水相(含0.1%甲酸水溶液)；流动相B为有机相(含0.1%甲酸甲醇溶液)。流速为0.4 mL·min-1，梯度洗脱：0～0.3 min，5%B；>0.3～0.6 min，5%→95%B，>0.6～2.1 min，95%B，>2.1～2.6 min，95%→5%B，>2.6～4 min，5%B。

1.5质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)，正离子模式下，多离子监控模式(multi reaction monitoning，MRM)，DADLE检测离子对为m/z570.2→120.4及570.2→136.3，毛细管电压5500 V，碰撞能54V(图1)。

1.6溶液配制 精密称取并配置DADLE母液1 mg·mL-1(50%甲醇)，临用前使用空白脑组织稀释成不同浓度的标准曲线及质控样品。

1.7脑组织取样及样品处理 在规定时间点，抓取大鼠并处死，沿枕骨内壁中线剪开颅骨暴露大脑，取完整脑组织置于研钵，加入适量液氮研磨匀浆后迅速置入1.5 mL离心管，-20 ℃冻存待测。检测时将脑组织样品置于常温融化后，取脑组织样品100 μL，加入甲醇-水(1：1)5 μL，涡旋混合，加入甲醇200 μL，涡旋混合，14 000×g离心30 min，取上清液10 μL进样分析。

1.8全脑缺血-再灌注模型大鼠脑组织浓度实验 采用前期已建立的二血管阻断加低血压法构建全脑缺血-再灌注大鼠模型[3-5]。造模成功后，单次经左侧颈静脉给药，给药剂量为2，5，10 mg·kg-1，于给药后10，120 min处死小鼠，取脑组织，按“1.7”项下方法处理分析进样。

图1 DADLE二级碎片特征子离子全扫描

2 结果

2.1方法选择性 取6个不同个体的空白脑组织100 μL，按“1.7”项下操作，进样 10 μL，得空白脑组织样品色谱图；配制0.1 ng·mL-1浓度的脑组织样品，依同法操作，DADLE的保留时间约为1.5 min。结果表明脑组织样品中内源性物质不干扰DADLE的测定(图2)。

2.2标准曲线及定量下限 取空白脑组织，配制成相当于DADLE脑组织浓度依次为1.00，2.0，5.0，20，100，500和 1000 ng·mL-1的样品，按“1.7”项下依法操作。以待测物浓度为横坐标，待测物的峰面积为纵坐标，用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程为Y=940.6660X-255.5192(r=0.995 2)。DADLE在0.1～1000 ng·mL-1线性关系良好，定量下限0.1 ng·mL-1，精密度为13.5%，相对误差为2.0%。

2.3精密度与准确度 取空白脑组织配制的低、中、高3个浓度(DADLE脑组织浓度分别为2.0，20和800 ng·mL-1)的质量控制(quality control,QC)样品，每一浓度进行 6样本分析，连续测定3个批次，根据当批次的标准曲线，计算QC样品的测得浓度计算本法的准确度与精密度(表1)。LC-MS/MS外标法测得DADLE在每一QC浓度水平的日内精密度RSD<10.0%，日间精密度RSD<11.6%，准确度在95.81%～99.19%。

图2 空白脑组织(A)及0.1 ng·mL-1 DADLE(B)色谱图

表1 DADLE在大鼠脑组织中的精密度与准确度

2.4回收率与基质效应 取空白脑组织配制的低，中，高浓度QC样品(脑组织中DADLE浓度分别为2.0，20和800 ng·mL-1)。同时另取空白脑组织及超纯水各100 μL，按“1.7”项下操作，向获得的全部上清液中分别加入低、中、高浓度对照品溶液5.0 μL，涡流混合后，14 000×g离心30 min，取上清液10 μL进样分析，获得相应峰面积。以每一浓度不同处理方法的峰面积比值计算处理回收率及基质效应。结果表明低、中、高QC样品处理回收率分别为(66.1±8.4)%，(72.3±5.5)%，(78.4±0.95)%，RSD分别为12.7%，8.8%，1.2%；基质效应分别为(104.0±12.6)%，(97.9±4.8)%，(91.3±3.7)%，RSD分别为12.1%，7.3%，4.0%。

2.5稳定性实验 本实验考察DADLE脑组织样品室温放置6 h的稳定性、经蛋白沉淀处理后在自动进样器放置24 h的稳定性、脑组织样品经历三次冷冻-解冻循环、脑组织样品-80 ℃ 放置30 d的稳定性，结果见表2。结果显示DADLE在上述条件下稳定性良好。

表2 DADLE在大鼠脑组织中的稳定性考察

2.6全脑缺血-再灌注模型大鼠脑组织浓度实验 模型大鼠单次经左侧颈静脉给药后10，20 min脑组织DADLE浓度见表3。检测结果提示经颈静脉给药10 min后，大鼠脑组织中DADLE浓度均处于较低水平(0.13～0.79 ng·mL-1)。在给药20 min后，DADLE在脑组织中水平有所提高(1.33～2.94 ng·mL-1)。单因素方差分析显示剂量对DADLE在脑组织中的浓度具有显著影响(P<0.05)。但给药10 min后，脑组织中DADLE的浓度水平与剂量呈反相关，高剂量10 mg·kg-1组中浓度平均水平仅为(0.13±0.10) ng·mL-1。给药20 min后，脑组织中DADLE浓度水平随剂量增加而提升，且差异有统计学意义(F=5.77，P=0.008)。

表3 全脑缺血-再灌注模型大鼠脑组织DADLE浓度

Tab.3 Concentration of DADLE in brain tissue of global cerebral ischemia-reperfusion model rats

表3 全脑缺血-再灌注模型大鼠脑组织DADLE浓度

剂量/(mg·kg-1)给药后10 min给药后20 min20.79±0.531.33±0.4550.46±0.412.23±1.10100.13±0.102.94±1.41

3 讨论

δ-阿片受体激动剂DADLE具有诱导心肌冬眠[6]，心脏、大脑、肺等器官缺血-再灌注损伤的保护作用[7-8]。无论是心脏骤停还是脑梗死，缺血-再灌注损伤均是克服缺氧缺血性脑损伤的中心环节[9]。在外源性药物对脑组织缺血-再灌注损伤的防护以外，中枢δ阿片受体的激活则在内源性保护中发挥关键作用。因此，人工合成的δ阿片受体激动剂DADLE有望通过外源性途径增强脑组织缺血-再灌注的内源性保护作用。本课题组前期研究中实践一种二血管阻断加低血压手段建立全脑缺血-再灌注大鼠模型。并在这种方法所构建的全脑缺血-再灌注的模型大鼠中发现DADLE可通过增加丝/苏氨酸蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的活化，抑制凋亡调控蛋白Caspase-3(cysteinyl asparatate specific proteinase 3)、Bax(Bcl-2 associated X)、Bcl-2(B cell lymphoma/leukemia-2)的表达程度，减少细胞凋亡，产生脑保护等脏器保护作用[3-5]。

3.1大鼠脑组织中DADLE检测方法的选择 针对DADLE的定量检测方法，多为基于液相系统的分析测试方法，如高效液相色谱-紫外光谱法、高效液相色谱-荧光光谱法、高效液相色谱-串联质谱法[10-11]。而脑组织中DADLE含量检测面临着更低检测限的挑战。此外，采用高效液相色谱-荧光光谱法涉及DADLE的柱前荧光衍生，虽然利用多维液相系统、固相萃取前处理方法能够增加检测方法的灵敏度，但同时也增加样品前处理的复杂性和检测时间。而液相色谱-串联质谱法由于具有较高的灵敏度、选择性，成为检测低浓度DADLE的适宜方法。因此，本研究采用液相色谱-串联三重四级杆质谱作为分析手段。考虑到处理动物、取脑组织、匀浆等复杂的取样过程，在脑组织样品的前处理部分，笔者采用简便、快捷的蛋白沉淀法。经验证，蛋白沉淀前处理方法配合液相色谱串联质谱分析法可满足DADLE在脑组织中的定量分析要求，最低定量限低至0.1 ng·mL-1。该方法简便、灵敏，可满足体内DADLE在低浓度分布组织中的定量检测需求。

3.2定量方法的选择 目前对DADLE的缺血-再灌注保护作用的研究多集中在体外实验。由于其浓度水平高，检测方法多为液相色谱-光谱法[10-11]。而对脑组织中DADLE含量测定，由于其低浓度水平，液相色谱-光谱法及液相色谱-质谱法均有报道。在液相色谱-质谱法中，报道均采用内标法进行定量，以减少操作及检测条件波动的影响[12]。然而，内标法对内标物质具有一定的要求，如结构、物理化学性质与分析物类似，但又可以分离。同时对实验人员的操作也有一定的要求。为了提高脑组织中DADLE含量测定的可操作性，本研究尝试使用DADLE对照品，在完全相同的操作下，使用外标法对脑组织中DADLE进行定量分析。通过线性、准确度、精密度、回收率、基质效应等指标的验证，本方法证实为一个简便、易操作的脑组织DADLE定量检测方法。

3.3液相质谱方法条件摸索 本方法采用常规的水-甲醇体系作为流动相。在其中加入0.1%甲酸以适应质谱离子源正离子模式并控制喷雾酸碱值。在预实验中，也显示含0.1%甲酸的水-甲醇体系用于脑组织样品测定时，较水-乙腈体系具有更少的干扰，基线和色谱峰形较好。质谱采用MRM，在碰撞能54 V条件下，选取两个碎片离子的离子对(m/z570.2→136.3、m/z570.2→120.4)对DADLE进行监测。除了文献报道的离子对m/z570.2→136.3以外，考虑到本研究采用外标法，增加m/z570.2→120.4离子对来对DADLE进行共同监测，通过两个离子对的共同监测，可排除其他离子干扰，保障对DADLE的高选择性。本方法检测脑组织中DADLE的浓度，由于脑组织脂溶性成分较高，在前期使用乙酸乙酯液液萃取法进行前处理样品干扰物质偏多，且回收率偏低，最低检测限偏高。因此，采用在样品前处理步骤，笔者采用简单的甲醇沉淀蛋白方法，经过验证，该方法简便，回收率可达到66%以上。本方法对脑组织基质效应的考察中显示，3个浓度质控样品其基质效应控制在91.3%～104%，这可能是由于本方法色谱分离时间控制在4 min，且采用梯度洗脱的液相方法，减少DADLE保留时间时的共流出物成分有关。虽然有报道指出，前处理采用固相萃取的方法能够有效降低检测的基质效应[12]。但本研究证明在本方法的条件下，简便的蛋白沉淀前处理方法能够提供不劣于复杂固相萃取前处理的效果。

3.4检测方法的应用与结果分析 在二血管阻断加低血压法建立全脑缺血-再灌注模型大鼠中，前期研究经颈静脉给药后10，20 min大鼠脑组织Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的变化。因此，笔者检测2，5，10 mg·kg-1剂量下经颈静脉注射给药10，20 min后脑组织中DADLE的含量，并对照蛋白表达水平评分初步探索这种变化是否具有一定的相关性。虽然DADLE在脑组织中的水平受到剂量的显著影响，但给药10 min后中、高剂量组DADLE浓度水平反而较低，而给药20 min后，脑组织中浓度又与给药剂量水平呈现一致趋势。除了因实验动物个体导致的差异以外，笔者推测DADLE需要一定时间完成由颈静脉跨越血脑屏障到达脑脊液，再分布到全脑组织这一过程。这一分布的快慢还可能受到脑血流量、脑组织脂肪含量、血脑屏障药物转运体表达水平等的影响。这一结果为后续研究DADLE脑组织保护的量效关系中，采样时间点的设置提供了宝贵经验。在初步的相关性分析中，Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平与给药20 min后DADLE脑组织浓度之间存在一定的指数型线性关系[Y=0.99ln(X)+0.61，R2=0.999 9]。而明确DADLE脑组织保护作用的量效关系模式尚需要进一步的研究，包括明确DADLE在大鼠脑组织中分布代谢消除时间，以及在这个过程中相关信号通路中蛋白表达水平的动态变化。而本方法的建立则提供一个快速、简单、专属性强的液相色谱串联三重四级杆质谱的定量检测方法，为后续探索DADLE脑组织保护作用的量效关系提供较好的技术支撑。