津力达颗粒对高糖诱导的大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡的影响*

乐岭，王永，孙慧伶，叶丽姿，朱梓依，李静，王之旸

(1.中国人民解放军中部战区总医院内分泌科，武汉 430070；2.湖北中医药大学第一临床学院，武汉 430065)

据统计，成年男性糖尿病患者中出现糖尿病性勃起功能障碍(diabetic erectile dysfunction，DED)的比例高达50%～75%[1]。DED的发病机制非常复杂，各种诱因如高血糖、氧化应激损伤、低激素水平、血脂异常等诱导的阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡(corpora cavemosum smooth muscle cells, CCSMCs)，是DED发生的重要病理生理学基础[2-5]。

目前针对DED的治疗方法有药物治疗和手术治疗，但无论是现有的药物治疗还是手术治疗，其疗效都非常有限，亟需寻找新的药物来帮助改善DED。

津力达颗粒是指南推荐的用于糖尿病及并发症治疗的中成药，能多角度干预糖尿病及其并发症[6-7]。笔者既往的研究发现，津力达颗粒能够明显改善高糖诱导的血管内皮细胞及人脐静脉内皮细胞的增殖及凋亡[8]。发现津力达可通过抑制ERK1/2磷酸化改善高糖诱导的CCSMCs表型转化[9]，但对于津力达与CCSMCs凋亡的关系尚无文献报道，本研究通过观察津力达对高糖诱导下SD大鼠CCSMCs凋亡的影响，探讨其防治DED的可能性。

1 材料与方法

1.1实验材料 津力达颗粒由以岭药业股份有限公司提供(国药准字Z20050845，批号：A1805010)；兔抗大鼠caspase-3(35/17KD)、兔抗大鼠bcl-2(26KD) 购自武汉三鹰生物技术有限公司(12789-1-AP)；兔抗大鼠 ERK1/2(42/44KD)购自 CST(4370)；兔抗大鼠p-ERK1/2(thr202/tyr204)(42/44KD)购自CST(4695)；内参GAPDH(37KD)抗体购自杭州贤至生物有限公司(AB-P-R 001)；PD98059 购自selleck(S1177)；细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物(KGA108，批号：KG061186)；流式细胞仪购自 BD Biosciences(FACSCalibur)；HRP标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司(BA1054)；ECL底物液购自Thermo(NCI5079)；X光胶片购自柯达(XBT-1)；显影定影试剂盒购自天津市汉中摄影材料厂(D-76，批号：20190309)；CCSMCs 原代细胞由南方医科大学韦安阳教授惠赠。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 细胞在含有5.5 mmol·L-1葡萄糖，10%胎牛血清，1%链霉素，1%青霉素和3 mmol·L-1谷氨酰胺的培养基中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。 每2天将细胞重新悬浮一次，当细胞生长至约90%时，用0.25%胰蛋白酶收获细胞，并以1：2或1：3传代。

1.2.2分组及干预 在药物干预之前，将所有细胞与5.5 mmol·L-1葡萄糖一起孵育24 h。将上述细胞分为6组：①正糖组(NG组)： 生理浓度葡萄糖5.5 mmol·L-1；②高糖组(HG组)：葡萄糖25 mmol·L-1[21]；③高糖+ PD98059组(HG+PD组)：葡萄糖25 mmol·L-1+50 μmol·L-1PD98059；④高糖+低浓度津力达组(HG+LJLD组)：葡萄糖25 mmol·L-1+津力达50 mg·L-1；⑤高糖+中浓度津力达组(HG+MJLD组)：葡萄糖25 mmol·L-1+津力达150 mg·L-1；⑥高糖+高浓度津力达组(HG+HJLD组)：葡萄糖25 mmol·L-1+津力达300 mg·L-1。各组均干预48 h。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒，依照说明书进行检测。取对数生长细胞，倒去培养液，将待测细胞以0.25%胰酶消化后离心收集，4 ℃预冷用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)将细胞润洗2次，1 000 r·min-1，离心半径r=24 cm，离心10 min，以PBS 100 μL重悬细胞，在细胞悬液中加入AnnexinV-FITC 5 μL，轻轻混匀后于5 ℃避光孵育15 min，加入PI染液10 μL，5 ℃避光孵育5 min，在1 h内采用流式细胞仪分析凋亡细胞比率。左下象限(FITC-/PI-) 显示活细胞，右下象限(FITC+/PI-) 显示早期凋亡细胞，左上象限(FITC+/PI+)为机械损伤细胞，右上象限(FITC+/PI+) 显示晚期凋亡及坏死细胞。

1.2.4Western blotting分析蛋白表达 取对数生长期的细胞等量均匀接种于25 cm2培养瓶中，每瓶容积5 mL。待细胞同步化后，在各实验组加入不同处理因素进行干预，每组设3个复瓶，培养24 h后，用4 ℃预冷的PBS冲洗3次，根据蛋白提取试剂盒操作说明提取各组细胞总蛋白，采用细胞总蛋白提取试剂(使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂)裂解并提取细胞总蛋白，Bradford 法测定蛋白浓度，每组蛋白质样本40 μg，在100 ℃下变性5 min，8% SDS-PAGE 分离蛋白，转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF膜)，室温下，5%脱脂奶封闭2 h，加入GADPH、ERK1/2、caspase-3(按1：1000稀释)，p-ERK1/2、bcl-2(按1：2000稀释)，4 ℃ 孵育过夜，TBST 在室温下脱色摇床上洗5次，每次5 min，加入二抗(1：50 000)室温振摇2 h，TBST洗5次，每次5 min。GAPDH作为内参对照。电化学发光显影。 Alpha Imager图像处理系统检测荧光条带并分析灰度值。

2 结果

2.1津力达对高糖诱导下CCSMCs凋亡的影响 与NG组比较，HG组CCSMCs细胞早期及晚期凋亡率显著升高(t=13.28，P<0.01；t=18.09，P<0.01)，表明高糖诱导CCSMCs发生凋亡。与HG组相比，HG+PD组细胞晚期凋亡率变化不明显(P>0.05)，但早期凋亡率明显降低(t=3.088，P<0.05)，说明高糖促进CCSMCs早期凋亡的作用可能与ERK1/2途径有关。津力达干预各组细胞早期、晚期凋亡率均较HG组明显下降，早期(t=7.554，P<0.05；t=7.111，P<0.01；t=7.029，P<0.01)；晚期(t=7.280，P<0.01；t=7.390，P<0.01；t=0.25，P<0.01)，说明津力达能有效抑制高糖诱导的CCSMCs早期和晚期凋亡。见表1、图1。

表1 各组CCSMCs 早期和晚期凋亡率

2.2津力达对高糖诱导下CCSMCs p-ERK1/2、bcl-2、caspase-3蛋白表达的影响 HG组p-ERK1/2及活化型caspase-3较NG组显著升高(t=13.38，P<0.01；t=10.61，P<0.01)，抗凋亡蛋白bcl-2显著降低(t=98.307，P<0.01)；HG+PD 组 p-ERK1/2及活化型caspase-3较NG组降低(t=3.986，P<0.05；t=3.84，P<0.05)；抗凋亡蛋白bcl-2升高(t=4.255，P<0.05)。加入不同浓度津力达干预后，津力达干预各组p-ERK1/2水平均较HG组降低，HG+HJLD组p-ERK1/2 水平降低更为显著(t=8.884，P<0.01)；津力达各组caspase-3水平较HG组有降低的趋势，HG+HJLD组caspase-3水平降低更明显(t=3.707，P<0.05)；津力达干预各组bcl-2水平较HG组显著升高并随津力达浓度增加呈递增趋势(t=5.235，P<0.01；t=6.048，P<0.01；t=5.373，P<0.01)，以上结果说明津力达干预升高了CCSMCs中抗凋亡蛋白bcl-2的表达水平；显著降低了p-ERK1/2、活化型caspase-3蛋白的表达水平。见表2、图2。

3 讨论

阴茎海绵体主要由血管、神经、CCSMCs和间质等构成。CCSMCs在正常人海绵体中的比例约为45%，是勃起组织的主要成分。据研究，勃起功能障碍发生及严重程度与阴茎海绵体组织结构改变有关，CCSMCs过度凋亡、勃起组织主要细胞成分 CCSMCs 减少及间质细胞增生是DED阴茎组织病理变化的重要特征[10-12]。

DED是糖尿病常见并发症之一，近年来，在对糖尿病患者进行阴茎海绵体活检中发现，存在CCSMCs的过度凋亡，其机制认为可能是高血糖状态下代谢紊乱改变凋亡调节基因的表达[2-3，12]。在众多凋亡相关基因中bcl-2是目前最受关注的基因之一。其中既包括凋亡抑制基因如bcl-2、bcl-xl、bag等，也包括凋亡诱导基因如bax、bcl-xs、bad等，具有双向调节细胞凋亡作用[13]。而caspase家族在诱导细胞凋亡的分子机制中也起着关键作用，是多条凋亡通路的汇聚点，在细胞凋亡的信号传递中caspase处于细胞凋亡下游，是执行凋亡的最终途径[14]。本研究发现，高糖状态下SD大鼠CCSMCs凋亡显著增加，促凋亡蛋白caspase-3表达显著增多，抗凋亡蛋白bcl-2表达明显下调。这与ALICI 等[12]和JESMIN等[15]学者认为DM可引起促凋亡因子caspase-3和bax活化，下调抗凋亡因子bcl-2的表达，导致海绵体组织凋亡的研究结果相一致。丝裂原活化蛋白激酶信号系统(MAPKs)是一组高度保守的丝氨酸/苏氨酸双重磷酸化蛋白激酶家族，存在于大多数原核生物和所有真核生物中，在细胞生物信号转导中起着十分重要的作用。它的途径主要包括3个平行的激酶： 细胞外信号调节的激酶(ERK)、c-Jun氨基未端激酶(JNK)和p38激酶[16]。 MAPK信号系统在所有的肌肉组织中均表达，包括骨骼肌、心肌和平滑肌等。有研究证明，高糖通过激活ERK1/2途径，在血管平滑肌细胞增殖、迁移、凋亡及表型变化中起作用[17-19]。CCSMCs是特殊的平滑肌细胞，在结构和功能上与血管平滑肌细胞非常相似，因此笔者推测ERK1/2通路可能参与CCSMCs凋亡。为了研究该通路是否参与高糖诱导的CCSMCs凋亡，首先研究了高糖是否改变ERK1/2的激活，然后使用特异性抑制剂(PD98059)来阻断该信号通路。结果显示，高糖可上调ERK1/2的磷酸化，而加入ERK1/2抑制剂(PD98059)下调ERK1/2的磷酸化，有效抑制了高糖诱导的CCSMCs凋亡。

1.NG组；2.HG组；3.HG+PD组；4.HG+LJLD组；5.HG+MJLD组；6.HG+HJLD组；①与 NG 组比较，P<0.01；②与HG组比较，P<0.05；③与HG组比较，P<0.01。

糖尿病中医称为糖络病，分为脾瘅(肥胖型)和消瘅(消瘦型)两大类型，全程分为郁、热、虚、损四个自然演变分期。DED为糖尿病气阴两虚并发症，参照《糖尿病中医防治标准(草案)》及《糖尿病中医药临床循证实践指南》，2型糖尿病并气阴两虚证时，建议加用口服津力达颗粒。

津力达颗粒是临床常用的降糖类中成药，由人参、黄精、苍术、苦参等中药组成，以益气养阴、健脾助运为主要治则，旨在纠正水谷津液在输布利用及代谢过程中的失衡，恢复脾脏传输水谷精微津液正常功能。已有研究[6-8]证实，津力达颗粒可以降低血糖，治疗糖尿病及其血管并发症，可明显改善高糖诱导的血管内皮细胞及人脐静脉内皮细胞的增殖及凋亡。本课题组既往的研究发现津力达颗粒上调海绵体平滑肌细胞表达α平滑肌肌动蛋白和碱性调宁蛋白，下调护骨素表达，维持细胞处于收缩型从而改善细胞功能。本研究还采用不同浓度津力达颗粒溶液对高糖状态下CCSMCs进行干预，发现在津力达颗粒预处理后，caspase3蛋白表达降低，抗凋亡蛋白bcl-2表达明显上调，CCSMCs凋亡显著降低，表明津力达颗粒可以有效抑制高糖诱导的CCSMCs凋亡。

表2 各组CCSMCs p-ERK1/2、Bcl-2、caspase-3 相对蛋白水平

1.NG组；2.HG组；3.HG+PD组；4.HG+LJLD组；5.HG+MJLD组；6.HG+HJLD组；①与NG组比较，P<0.01；②与HG组比较， P<0.05；③与HG组比较， P<0.01。

同时，津力达颗粒干预后，p-ERK1/2蛋白表达显著降低。提示p-ERK1/2可能在高糖诱导CCSMCs凋亡和津力达颗粒保护中起重要作用。

综上所述，津力达颗粒能够明显改善高糖诱导的CCSMCs凋亡，该保护作用可能与津力达颗粒抑制ERK1/2的磷酸化，改变凋亡相关蛋白表达相关。这对于应用津力达颗粒治疗DED提供了一定的理论基础和新的思路。