解毒抗癌巴布剂中主要成分体外释放度及离体小鼠经皮渗透行为研究*

黄文涛，张耕，胡松，杨全伟

(武汉市第一医院药学部，武汉 430022)

解毒抗癌巴布剂为武汉市中医院肿瘤科临床使用多年的协定处方，由水牛角、栀子、陈皮、赤芍、白花蛇舌草、半枝莲等10味中药组成，具有解毒、化瘀抗癌、扶正驱邪的功效，用于癌症晚期止疼抑癌的治疗。方中水牛角为君药，栀子、陈皮、赤芍为臣药。辅助君药解毒，扶正抗癌。为了考察解毒抗癌巴布剂的释放量及透皮率，本实验以解毒抗癌巴布剂处方中的栀子、陈皮、赤芍中活性成分为考察指标，来研究解毒抗癌巴布剂的透皮性能，同时对解毒抗癌巴布剂给药后的药动学进行研究[1]，为临床治疗提供理论及数据支撑。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waterse2695高效液相色谱仪(美国，自动进样器，紫外检测器：Waters2489)；BP211D电子天平(德国赛多利斯，感量：0.01 mg)；KQ-300DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RYJ-6A型药物透皮扩散试验仪(上海黄海药检仪器厂)；岛津LC-16型色谱仪；艾柯超纯水机(EXCEED 型，成都艾柯水处理有限公司)。

1.2试药 栀子苷对照品(批号：749-201309，中国食品药品检定研究院，含量≥98%)；芍药苷对照品(批号：110736-201438，中国食品药品检定研究院，含量≥99%)；橙皮苷(批号：110721-201211，中国食品药品检定研究院，含量≥99%)；甲醇为色谱纯(国药控股有限公司)，乙腈为色谱纯(美国TEDLA公司)；超纯水；自制解毒抗癌巴布剂(批号：18121500)。

1.3实验动物 SPF级雌性小鼠(6～8周)，体质量(20±5) g，由湖北省疾病预防控制中心动物实验室提供，合格证号：NO.4200695787，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2008-0030。饲养环境：屏蔽环境，普通维持饲料，自由饮水，室温(22±3) ℃，相对湿度(55±5)%，12 h光照黑暗循环。

2 条件与方法

2.1色谱条件 色谱柱为依利特Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速：1.0 mL·min-1，流动相：乙腈(A)：0.2%磷酸(B)=15：85；检测波长：250 nm，柱温：25 ℃，进样量：20 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品混合溶液的制备 精密称取减压干燥至恒重的栀子苷、芍药苷、橙皮苷对照品适量至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分别制成栀子苷、芍药苷、橙皮苷浓度为202.8，173.4，225.2 μg·L-1对照品混合储备液，保存备用。

2.2.2供试品溶液的制备 称取适量的明胶，加水浸泡溶胀制成明胶胶体液，依次加入甘油、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、高岭土，搅拌均匀制成粘性适中的基质浆料，加入解毒抗癌巴布剂流浸膏，边加边搅拌，放置熟化，制成巴布剂膏体，调节好涂布规格，涂布、晾干(减压干燥下抽干空气和气泡)，按规格切割成片。

取解毒抗癌巴布剂一贴(批号：18121501)，除去盖衬，称取药膏约0.2 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声提取(120 W，频率42 kHz)30 min后静置放冷，补重，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3阴性样品溶液的制备 分别取解毒抗癌巴布剂的缺栀子、赤芍、陈皮3味中药，其余按比例称取，制备成阴性巴布剂，按“2.2.2” 项下供试品溶液的制备方法制备，分别制成缺栀子阴性样品溶液、缺赤芍阴性样品、缺陈皮阴性样品和缺栀子、赤芍、陈皮样品。

3 方法学考察

3.1专属性考察 分别取“2.2”溶液制备的对照品混合溶液、供试品溶液，阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样20 μL，并记录色谱图，见图1。通过高效液相色谱图可知，供试品溶液的3个目标主峰保留时间分别与对照品溶液的主峰保留时间对应一致且无干扰，阴性样品溶液在相应的保留时间位置无干扰峰出现，表明该方法专属性良好。

3.2线性关系考察 取“2.2”项下混合对照品储备液，精密吸取对照品储备液1，2，3，4，5，10 mL，分别置于50 mL量瓶中，各加入50%甲醇稀释溶解，定容至刻度，分别制成栀子苷系列浓度为4.056，8.112，12.168，16.224，20.28，40.56 μg·L-1；芍药苷系列浓度为3.468，6.936，10.404，13.872，17.34，34.68 μg·L-1；橙皮苷系列浓度为4.504，9.008，13.512，18.016，22.52，45.04 μg·L-1的系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样20 μL，分别记录栀子苷、芍药苷、橙皮苷峰面积，以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，分别进行线性回归，绘制标准曲线，计算回归方程为：栀子苷Y1=1.578×104X1-3.789×103(r=0.999 7)；芍药苷Y2=8.79×105X2-1.764×103(r=0.999 6)；橙皮苷Y3=7.89×104X3-5.78×103(r=0.999 8)。结果表明，栀子苷在4.056～40.56 μg·L-1，芍药苷在3.468～34.68 μg·L-1，橙皮苷在4.504～45.04 μg·L-1浓度范围内与峰面积线性关系良好。

3.3精密度考察 取上述混合对照品储备液，分别精密吸取5 mL，置于50 mL量瓶中，加入50%甲醇稀释溶解，定容至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果，栀子苷峰面积的RSD为0.74%；芍药苷峰面积的RSD为0.98%；橙皮苷峰面积的RSD为0.83%(n=6)，表明仪器精密度良好。

3.4稳定性实验 取解毒抗癌巴布剂(批号：18121501)，称取约0.2 g，精密称定，按上述“2.2”项下供试品溶液的制备成供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时按“2.1”项下色谱条件分别进样20 μL，分别记录峰面积，结果栀子苷峰面积的RSD为1.22%(n=6)；芍药苷峰面积的RSD为1.78%(n=6)；橙皮苷峰面积的RSD为1.09%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.5重复性实验 取解毒抗癌巴布剂(批号：1812-1501)的样品，分别称取6份，各约0.2 g，精密称定，按上述“2.2”项下供试品溶液的制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图，计算各组分的平均含量，结果栀子苷、芍药苷和橙皮苷平均含量分别为1677，2104，3241.5 μg·g-1，分别计算RSD为1.23%(n=6)、1.78%(n=6)、1.95%(n=6)，表明该方法重复性良好。

3.6加样回收率实验 精密称定解毒抗癌巴布剂(批号：18121501)已知含量的解毒抗癌巴布剂6份，各约0.1 g，精密称定，分别加入适量栀子苷、芍药苷、橙皮苷对照品，按上述“2.2”项下供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算回收率，结果见表1。加样回收率结果可知，计算RSD分别为1.49%，1.13%，1.58%，表明该实验结果良好，方法可行。

1.栀子苷；2.芍药苷；3.橙皮苷。

3.7样品含量测定 取解毒抗癌巴布剂3批(批号：18121501、18121601、18121701)，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行测定栀子苷、芍药苷、橙皮苷的含量，结果见表2。

4 释放度实验

按2015年版《中华人民共和国药典》(四部)项下0931关于溶出度与释放度测定法第四法桨碟法进行操作。用不锈钢筛网(孔径2 mm×2 mm)做成网碟2个，精确称取解毒抗癌巴布剂0.20 g，将其用网碟2个固定，同时使巴布剂药面朝上，置于500 mL烧杯中部，加入37 ℃的0.9%氯化钠溶液500 mL，保持恒温，采用搅拌桨进行匀速搅拌，分别10，30，60，90，120 min时精密吸取100 mL溶液，取样后分别再注入恒温0.9%氯化钠溶液100 mL。

4.1供试品溶液的制备 将5个不同时间点取得释放液，分别置于蒸发皿中，水浴浓缩至干，残渣加70%甲醇溶解，定容至5 mL量瓶中，滤过，取续滤液即得。

4.2释放度测定及结果 将上述不同时间点制备的供试品溶液，按照上述“2.1”项下色谱条件，进样检测，记录峰面积，计算释放含量，结果栀子苷在10，30，60，90，120 min的累积释放度分别为12.75%，39.27%，48.76%，67.84%，83.81%；芍药苷的累积释放度分别为14.36%，37.55%，52.10%，66.88%，84.17%；橙皮苷的累积释放度分别为10.27%，36.74%，49.10%，58.22%，79.38%。

5 离体小鼠透皮率测定

取SPF级小鼠，脱颈处死，用8%硫化钠溶液脱毛，用剪刀从腹部剥离整个皮肤，用0.9%氯化钠溶液洗净[2-3]，采用改良的Franz扩散池，将鼠皮背部朝下，腹部皮肤朝上，固定于接收池上，称取解毒抗癌巴布剂0.20 g，精密称定，紧贴置于鼠皮肤处，接收池内加满0.9%氯化钠溶液，水域恒温保持在(37±1) ℃，开启磁力搅拌(设置搅拌速度为200 r·min-1)，分别于2，4，6，8，10，12，24 h，取出接收池中的接收液，同时补充同量的恒温0.9%氯化钠溶液(37±1) ℃[2-9]。

5.1解毒抗癌巴布剂供试品溶液制备 分别将6次接收液分别水浴蒸干，残渣加70%甲醇溶液洗涤，置于1 mL量瓶中，并定容、摇匀，过微孔滤膜，即得。

表2 样品含量测定结果

5.2离体透皮率含量测定 将上述供试品溶液分别按“2.1”项色谱条件注入高效液相色谱仪，进样20 μL，检测，分别计算供试品中栀子苷、芍药苷、橙皮苷的含量及经皮渗透的动力学拟合，结果见表3，4。

5.3结果 由表4可知，解毒抗癌巴布剂中栀子苷动力学拟合方程中，拟合度最高为0.976，符合Higuchi方程；芍药苷动力学方程中，拟合度最高为0.964，符合Higuchi方程；橙皮苷动力学方程中，拟合度最高为0.997，符合Higuchi方程。

由图2结果可知，解毒抗癌巴布剂中离体小鼠透皮率，3个有效成分含量均为逐步缓慢释放，表明该制剂为骨架型控释制剂。

6 讨论

解毒抗癌巴布剂处方中，方中水牛角为君药，栀子、陈皮、赤芍为臣药。辅助君药解毒，扶正抗癌。其君药水牛角无具体的含量测定指标，故选择臣药栀子、陈皮、赤芍中的有效成分来考察解毒抗癌巴布剂的释放量及透皮率，同时3个成分含量的测定可用于该制剂的质量控制。

表3 栀子苷、芍药苷、橙皮苷的离体透皮率测定结果

预实验考察了乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水，乙腈-0.2%磷酸水等不同流动相系统进行洗脱，发现流动相选择乙腈-0.2%磷酸水时，3个色谱峰可以达到基线分离，然后对其流动相比例进行优选，最终选择乙腈-0.2%磷酸水=15：85，分离效果最好。

表4 经皮渗透动力学拟合方程

图2 解毒抗癌巴布剂中栀子苷、芍药苷、橙子苷累积透皮量-时间变化曲线

通过紫外分光度计对混合对照品进行全波长扫描，在250 nm处，3个有效成分有最大的紫外吸收，故本实验最终选择吸收波长为250 nm。

缓释制剂释药主要是溶出原理，扩散原理及溶蚀与扩散、溶出结合作用。骨架型主要有3种类型：溶蚀性骨架片，不溶性骨架片和亲水性凝胶骨架片，释药机制各不相同。由不可溶解但可溶蚀的蜡质材料制成的溶蚀性骨架片是通过孔道扩散与蚀解控制药物来释放。不溶性骨架片的药物释放是液体穿透骨架，将药物溶解然后从骨架的沟槽中扩散出来，故孔道扩散为限速步骤，释放符合Higuchi方程。