体内外方法检测化妆品用防腐剂的致敏性

张 明，袁 园，张丽霞，张宏伟，*

(1．中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所毒理室，北京 100021；2．浙江大学华南工业技术研究院化妆品创新研究中心，广东 广州 510535)

化妆品的安全性是由化妆品的原料决定的，而化妆品中的防腐剂是化妆品常用的原料，也是引起化妆品过敏反应，即过敏性接触性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)的重要因素之一，化妆品过敏性接触性皮炎是皮肤接触致敏物质后引发的迟发型过敏反应。

由于国外对动物试验的禁令及对动物替代试验的推行，皮肤致敏的检测方法已开发出一系列体外替代检测方案[1]。其中经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)推荐的人类细胞系活化试验(human cell line activation test，h-CLAT)是检测皮肤致敏过程中细胞表面分化抗原簇86(cluster of differentiation 86，CD86)和分化抗原簇54(cluster of differentiation 54，CD54)的表达来判定待测物是否具有致敏性，通过荧光染色测量人髓系白血病单核细胞(human myeloid leukemia mononuclear cells，THP-1)表面分子的表达来判定待测物是否具有致敏性。当致敏物接触THP-1细胞会引起其表面分子CD86和CD54的上调，说明THP-1细胞被活化，发生了皮肤致敏过程。豚鼠局部封闭涂皮试验(occluded patch test of Buchler，BT)是用受试物诱导过的动物再次接触同种受试物所表现出的皮肤反应来判定受试物是否具有致敏性，该方法是国际上评价化学物皮肤致敏性的经典方法，我国部分国家标准或规范也将该方法列为致敏性试验方法之一，对化学物质进行致敏性测试。h-CLAT 试验与BT试验相比，测试结果是否一致，本研究拟采用体外人细胞系活化试验和豚鼠局部封闭涂皮试验对化妆品常用的2 种防腐剂进行致敏性检测，对比两种方法检测的一致性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及分组北京科宇动物养殖中心提供的健康普通级白化豚鼠，动物生产许可证号SCXK(京)2018-0010，体质量为300～350 g。将40 只动物随机分为受试物试验组和对照组。

1.1.2 细胞来源及培养条件THP-1细胞购于中国食品药品检定研究院，培养于含10%胎牛血清、1%双抗、0.05 mmol/L β-巯基乙醇的RPMI1640基础培养液中，在37 ℃、CO2体积为5%的培养箱内常规培养。

1.1.3 试验试剂RPMI1640 培养基、胎牛血清、β-巯基乙醇、双抗、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液均购自Sigma公司；Fc 段受体阻断剂、7-氨基放线素菌-D(7-AAD)、FITC标记小鼠单克隆CD86抗体、FITC标记小鼠IgG1抗体、PE标记小鼠单克隆CD54抗体、PE标记小鼠IgG1抗体均购自BD公司。

1.1.4 主要仪器流式细胞仪，型号FACS Calibur，购自BD 公司；台式高速冷冻离心机，型号GS-15R，购自美国Beckman公司；二氧化碳培养箱和Varioskan Flash 全波长多功能读数仪均购自Thermo Scientific 公司；超声仪、自动细胞计数仪、电热恒温水箱。

1.1.5 对照物和测试样品BT试验和h-CLAT试验的阳性对照物质采用 2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB)，BT试验诱导和激发所用样品分别为0.5%和0.1%的丙酮溶液，h-CLAT 试验中将其先溶解于少量DMSO 中，再用细胞培养液稀释到测试浓度，其中DMSO 在培养液中浓度不高于10%。阴性对照物质甘油和测试样品羟苯乙酯、羟苯丁酯均购自Sigma公司。

BT 试验中用甘油溶解羟苯乙酯、羟苯丁酯，h-CLAT试验中将其溶解于少量DMSO中，再用细胞培养液稀释到各个测试浓度。

1.2 豚鼠局部封闭涂皮试验[2]

按照1.1.1所述的动物情况分组，受试物组给予的羟苯乙酯的诱导及激发浓度分别为50%和40%的甘油溶液，羟苯丁酯的诱导及激发浓度分别为0.5%和0.2%的甘油溶液。

试验前约24 h，将豚鼠背部左侧用动物电推剪去毛，去毛范围为6 cm2。

诱导接触：将上述配置好的受试物约0.2 mL涂在试验动物去毛区皮肤上，以二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以医用白色胶布封闭固定6 h，第7 和第14 天以同样方法重复1 次。阳性对照组动物用阳性物质(0.5%的2,4-二硝基氯苯的丙酮溶液)做同样处理，阴性对照组动物诱导时采用甘油。

激发接触：末次诱导后14 d，将约0.2 mL的受试物涂于豚鼠背部右侧2 cm×2 cm去毛区，试验前24 h去毛，然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以医用白色胶布固定6 h。阳性对照组采用0.1%的2,4-二硝基氯苯丙酮溶液处理，阴性对照组分别采用40%羟苯乙酯的甘油溶液或0.2%羟苯丁酯的甘油溶液处理。

激发接触后24 和48 h 观察皮肤反应，当动物出现皮肤反应积分≥2，判为该动物皮肤变态反应阳性，按表1判定受试物的致敏强度。

1.3 体外人细胞系活化试验[3]

1.3.1 THP-1 细胞培养THP-1 细胞于培养瓶中水平培养，镜下观察细胞状态，每隔3 d 进行一次传代培养。细胞使用前每隔24 h进行活细胞染色计数，计算细胞平均倍增时间，确定细胞稳定性。细胞的使用不超过20代。

1.3.2 受试物细胞毒性检测受试物溶解于少量DMSO 中，再用RMPI 1640 完全细胞培养液(含0.05 mmol/L β-巯基乙醇、10%胎牛血清、1%双抗的RPMI 1640 基础培养液，pH=7.2)稀释，2 倍稀释配制6个浓度值。采用试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)方法检测细胞毒性，细胞以2×105个/mL的初始浓度培养2 d 后，将细胞浓度调节至1×106个/mL。取受试物溶液和细胞悬液各100 μL 混合接种至96 孔平底板上，每个浓度设置3 个平行复孔。每次同时设置阳性对照、溶剂对照(细胞和培养液1∶1 混合)、空白对照(除细胞外的其他介质)。将96孔板置于37 ℃细胞培养箱培养24 h后，每孔加入20 μL的染液，置于培养箱培养3 h。450 nm 波长下使用酶标仪测定每孔吸光度D(450)值。

细胞活性=[D(450)受试孔-D(450)空白孔]/[D(450)对照孔-D(450)空白孔]

通过受试物细胞毒性预试验结果，经R 软件分析处理，计算细胞存活率75%时的暴露浓度(75% cell viability，CV75)。

1.3.3 有效作用浓度计算对于具有致敏性的物质，进一步进行有效作用浓度(effective concentration，EC)值的计算。对CD86计算EC150，即CD86的相对荧光强度(relative fluorescence intensity，RFI)达到150 时受试物的最低有效浓度。对CD54 计算EC200，即CD54 的RFI 达到200 时受试物的最低有效浓度。选取RFICD86＞150或RFICD54＞200的最低浓度作为CA(μg/mL)，RFICD86＜150或RFICD54＜200的最高浓度作为CB(μg/mL)。

CA为RFI≥150(CD86)或200(CD54)的最低浓度；CB为RFI＜150(CD86)或200(CD54)的最高浓度。RFIA为A浓度所对应的RFI；RFIB为B浓度所对应的RFI。

若所测浓度范围内RFI 均＞150(CD86)或200(CD54)，选用公式(3)计算EC150，选用公式(4)计算EC200。

CB为受试范围内最低浓度；CA为比RFIB大至少10%的RFI所对应的最低浓度。

1.3.4 THP-1细胞CD86和CD54表达测定根据已经测得的CV75值，结合细胞存活率介于65%～95%之间，1.2倍稀释得到6个浓度。细胞以2×105个/mL的初始密度培养2 d 后，离心调节浓度至2×106个/mL。取受试物和细胞各500 μL，1∶1 混合接种于24 孔板上。每次试验设立培养基对照、DMSO 溶剂对照和阳性对照(2.5 μg/mL 的DNCB)。孔板置于细胞培养箱中孵育24 h，用1 mL 的染色缓冲液清洗一次，进行Fc段抗体封闭和7-AAD 染色10 min，再次清洗后进行抗体染色(FITC-CD86、PE-CD54)和同型对照染色(FITC-IgG1、PE-IgG1)。染色完成后加入200 μL染色缓冲液清洗两次，用500 μL的FACS缓冲液重悬细胞移至流式管中待用。用空白细胞和单染细胞调节电压补偿，按下式计算RFI。

荧光强度均值(mean fluorescence intensity，MFI)为荧光强度几何平均数。

1.3.5 受试物致敏性判定化学物质至少需要两次独立试验。每次试验要求细胞存活率大于50%，如果RFICD86≥150，则判定为CD86 表达阳性；RFICD54≥200，则判定为CD54 表达阳性。两次试验中CD86 和CD54任一指标两次判定为阳性，则判定该物质具有致敏性。如果两次试验CD86和CD54的表达均不具有一致性，则进行第3 次试验。若第3 次试验中CD86 和CD54表达均为阴性，判定为非致敏物，否则判定该物质具有致敏性。

1.4 统计学方法

试验数据采用R 软件进行分析，受试物羟苯乙酯组、羟苯丁酯组、阳性对照DNCB 组和阴性对照甘油组的CD86与CD54的相对荧光强度值间的差异分析采用单因素分析进行比较，以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 豚鼠局部封闭涂皮试验结果

通过豚鼠局部封闭涂皮试验，对化妆品常用的防腐剂羟苯乙酯、羟苯丁酯进行了致敏性测试，于最后一次激发接触后的24 h 和48 h 对试验动物进行皮肤观察，结果见表2，其中阴性对照组致敏率为0，阳性对照组DNCB 致敏率最低为40%，该试验成立，待测物羟苯乙酯对豚鼠的致敏率为0，羟苯丁酯在第24 h对豚鼠致敏率为45%，第48 h 时对豚鼠致敏率为30%，按表1 所列的致敏强度判定标准，待测物羟苯乙酯为非无致敏物，羟苯丁酯为中等致敏物。

表2 受试物或对照物对豚鼠皮肤变态反应试验结果(BT法)

2.2 体外人细胞系活化试验结果

2.2.1 细胞毒性检测结果利用CCK-8 法对受试物质羟苯乙酯、羟苯丁酯以及阳性对照物质DNCB 及阴性对照物质甘油的细胞毒性进行了测试，结果见表3。其中阴性对照物质甘油的CV75值大于5 000 μg/mL，阳性对照物质DNCB 的CV75值为2.5 μg/mL，符合OECD 相关方法中的参考值范围，该试验成立，待测物羟苯乙酯在测试浓度下的CV75值为126 μg/mL，羟苯丁酯在测试浓度下的CV75值为18 μg/mL。

2.2.2 CD86 和CD54 的有效作用浓度依据试验情况，选用1.3.3 所列公式，计算受试物的CD86 的最低有效浓度(EC150)及CD54的最低有效浓度(EC200)。两次独立平行试验中选取较高的EC150和EC200值作为最终值。

测试物质致敏性的两次测定结果的EC值见表4。

表3 受试物质细胞毒性CV75值

表4 测试物质的EC150和EC200值

2.2.3 测试物质CD86 和CD54 的相对荧光强度值参考上述试验中CV75值，在细胞存活率65%～95%范围内，选取6 个剂量，测得待测物质的CD86 和CD54 的相对荧光强度和细胞活率，具体结果见表5。

表5 测定样品的相对荧光强度值

2.3 BT试验与h-CLAT试验结果对比

将上述豚鼠局部封闭涂皮试验与体外人细胞系活化试验获得的各个化学物质的致敏强度结果进行对比，结果见表6。

表6 BT法与h-CLAT试验测试致敏性结果

3 讨 论

欧盟现行化妆品法规第1223/2009 号条例于2009年颁布，2013年7月全面生效，取代1976年颁布的欧盟化妆品的理事会76/768/EEC指令，成为欧洲化妆品行业的统一法规，新法规继续保留了禁止动物试验的规定，加强替代方法的研发投入与支持，鼓励替代方法的运用，将成为未来对药品、化妆品安全性评价的主要趋势。

欧洲替代方法研究中心(ECVAM)已完成对h-CLAT 试验的可行性 验 证，2015 年12 月，OECD 已经公布了该方法草案，并于2016年正式列为OECD的毒理学测试方法。Ashikaga 等[4]通过检测细胞CD86 和CD54 的表达水平对100 种化学物的致敏性进行了判定，h-CLAT 与小鼠局部淋巴结试验结果的一致性可达84%，h-CLAT 不仅能分辨出极强度致敏和强致敏，而且能分辨出中度致敏和弱致敏。Parise等[5]发现受试物经过暴露48 h后，可以用h-CLAT 法通过分析THP-1细胞CD86的表达水平将23种致敏物质的22种鉴定出来，结合CD86 和白细胞介素-8 的分析对致敏物可做综合判断。

羟基苯酯类是世界上使用广泛的防腐剂，其中羟苯乙酯，羟苯丁酯是常见的化妆品用防腐剂，随着人们，尤其是女性消费者对化妆品的使用量日趋上升，其对人们的皮肤及其身体健康的影响亦受到越来越多的关注，由化妆品引起的皮肤致敏性是重要关注点。本研究选用体外人细胞系活化试验和豚鼠局部封闭涂皮试验测试化学物的皮肤致敏性，两种方法对阳性对照和阴性对照均做出正确判断，说明试验方法可靠。体外人细胞系活化试验检测两种化妆品防腐剂均为致敏阳性，羟苯乙酯为弱致敏物，羟苯丁酯为强致敏物。利用体外方法检测羟苯脂类的致敏性文章报道不多，2015 年Sonnenburg 等[6]采用体外培养的外周血单核细胞检测羟苯脂类的致敏性，结果显示羟苯乙酯为弱致敏，羟苯丁酯为强致敏，尽管与本实验采用的测试细胞系不同，两者的检测结果相一致。利用h-CLAT 试验方法，通过测定CD86 和CD54 的表达对羟苯乙酯，羟苯丁酯的致敏性测试，还未见相关报道。豚鼠局部封闭涂皮试验检测羟苯乙酯为非致敏物，羟苯丁酯为中度致敏物。由于国外近年来禁止动物试验，采用豚鼠进行的测试，多是较早期的报道，1952年Sokol[7]利用豚鼠皮下注射方法，对羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯4 种物质的测试结果显示，4种物质均未出现致敏性。

上述两种方法检测皮肤致敏性，采用的方式和原理不同，豚鼠法是模拟人体经皮肤接触化学物后引起致敏的全过程，含有测试物质需要透皮的环节，而体外细胞方法是通过对皮肤致敏过程中CD86和CD54表达的测定从而来判定受试物是否具有致敏性。从施用方式上而言，前者更接近与人体接触的真实情况，但动物试验也存在种属差异的问题，本研究的体内试验未采用二次激发观察致敏情况，也可能是其敏感性及检出率低的原因，在后期将对此进一步研究、探讨。h-CLAT 试验通过细胞方法测试，虽然检测特异性高，但也不排除假阳性的可能。此外，两种方法致敏强度分级标准也不尽相同，可能导致同一物质采用不同的试验方法，结果被判定为强或弱的等级不完全一致。

如上所述，许多研究者认为，目前单一体外替代方法不能完全替代动物试验，单一方法可以作为筛选性试验，应采用更多的组合策略对致敏性进行测试。