mTOR抑制剂AZD2014对肝癌细胞的增殖抑制作用及其机制研究

林凯煌，蔡高阳，刘新城

(1．汕头大学医学院第二附属医院胃肠外科，广东 汕头 515065；2．汕头大学医学院第二附属医院泌尿外科，广东 汕头 515065)

肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一，近年来，其发病率和病死率均有升高的趋势[1]。对于早期肝癌患者来说，最有效的治疗方式包括肿瘤局部消融、手术切除和肝脏移植治疗；但对于中晚期肝癌患者，研究者们却尚未找到合适的治疗方法[2-4]。近年来，分子靶向药物治疗的出现给中晚期肝癌患者带来了新希望[5]，科学家们把可以同时阻断mTORC1 和mTORC2信号的哺乳动物雷帕鸣靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制剂称为双mTOR 抑制剂，目前比较常见的双mTOR 抑制剂有PP244、AZD8055 及AZD2014 等，有研究表明，双mTOR 抑制剂AZD2014有较强的抗肿瘤作用，它可以诱导肿瘤细胞出现凋亡、细胞周期阻滞和自噬，且可抑制肿瘤细胞的上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)进程[6-7]。然而截至目前，AZD2014的作用靶点尚不清楚。有研究表明，肿瘤细胞中含植物同源结构和环指域泛素样蛋白1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1)的表达可被mTOR 抑制剂Torin-2显著抑制[8]，这表明UHRF1可能是mTOR 抑制剂Torin-2发挥抗肿瘤作用的药物靶点。我们的前期研究表明，mTOR 抑制剂AZD2014 具有明显的抗肿瘤作用[6]。为进一步确定UHRF1 是否为mTOR 通路抑制剂发挥抗肿瘤作用的药物靶点。我们用不同浓度的AZD2014 来处理人肝癌细胞HCCLM3，并检测AZD2014对肝癌细胞增殖及细胞中UHRF1表达水平的影响，进而探讨AZD2014在肝细胞癌中发挥抗肿瘤作用的机制。

1 材料与方法

1.1 受试物

HCCLM3 细胞购于复旦大学肝癌研究所；AZD2014 购于美国Selleckchem 公司；Trizol、逆 转 录试剂盒及荧光定量PCR 试剂盒均购于日本TaKaRa 公司；CCK-8试剂盒购于日本同仁公司；UHRF1抗体购于美国Abcam公司。

1.2 CCK-8法检测细胞增殖情况

将适量状态良好的HCCLM3 细胞接种于96 孔板中，置于37 ℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待细胞生长至底面覆盖率为30%～40%时分别加入完全培养基和不同浓度的受试物，实验分为空白对照组，阴性对照组，AZD2014 10、100、500、1 000 nmol/L 组。继续培养细胞，分别于加入受试物后0、24、48、72及96 h按操作说明向各细胞培养孔中加入适量CCK-8 溶液，37 ℃条件下孵育1 h，然后用酶标仪测定不同时间点各细胞培养孔在450 nm处的吸光度D(450)，并以此绘制各组细胞的增殖曲线。

1.3 荧光定量PCR 检测肝癌细胞内UHRF1 mRNA的表达

HCCLM3细胞经不同浓度AZD2014处理96 h后弃去旧培养基，冷PBS 洗涤细胞2 次，再向各培养孔中加入适量Trizol，轻轻摇动培养板，使细胞裂解液流遍所有细胞表面，反复吹打使其充分裂解成匀浆，加入氯仿，离心后取上清，再加入异丙醇，离心后用75%乙醇洗脱，风干后用灭菌用水溶解，测定RNA浓度后取适量RNA按说明配制反应体系进行逆转录反应，再取适量反应产物按荧光定量PCR试剂盒说明配制反应体系并进行反应(引物序列见表1)，根据每个样品不同复孔的CT值计算各组平均CT值及△CT值(△CT=CT，UHRF1-CT，GAPDH)，并由此计算出2-ΔΔCT值。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.4 Western blot检测肝癌细胞内UHRF1蛋白的表达

HCCLM3细胞经不同浓度AZD2014处理96 h后用RIPA 裂解液与蛋白酶抑制剂PMSF 提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，裂解并煮沸变性后，取适量蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后封闭非特异性抗体，再加上合适浓度的UHRF1 抗体，4 ℃孵育过夜；次日洗净UHRF1 抗体后加上HRP 耦联的二抗，摇床上室温孵育1 h，洗净后进行化学发光检测、图像采集，之后再根据ImageJ软件计算出的各蛋白条带的相对灰度值来计算蛋白的相对表达水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析。计量资料用±s表示，实时荧光定量PCR数据分析采用单因素方差分析，增殖实验数据分析采用单因素方差分析。检验水准为α=0.05，采用双侧性检验。

2 结 果

2.1 不同浓度AZD2014对肝癌细胞增殖能力的影响

细胞增殖实验结果显示，10、100、500、1 000 nmol/L 的AZD2014 均可显著抑制肝癌细胞的增殖能力，抑制作用程度与其浓度呈正相关(P＜0.05)，且AZD2014 在浓度为500 和1 000 nmol/L 时对肝癌细胞的增殖抑制作用最强(P＜0.05，图1)。

图1 不同浓度AZD2014对肝癌HCCLM3细胞增殖的影响

2.2 AZD2014 对肝癌细胞中UHRF1 mRNA 表达的影响

实时荧光定量PCR 检测结果见图2，与空白对照或阴性对照组相比，可见HCCLM3 细胞中UHRF1 mRNA 的表达水平在经500 和1 000 nmol/L AZD2014处理后显著下降(P＜0.05)，且浓度为1 000 nmol/L 时最明显，但10 和100 mmol/L 浓度的AZD2014 对HCCLM3 细胞中UHRF1 mRNA 的表达水平无明显影响。据此我们初步认为，UHRF1可能是mTOR抑制剂AZD2014发挥抗肿瘤作用的药物靶点。

图2 不同浓度AZD2014对肝癌细胞内UHRF1 mRNA表达的影响

2.3 AZD2014对肝癌细胞中UHRF1蛋白表达的影响

Western blot 检测结果见图3，与空白对照或阴性对照组相比，可见HCCLM3细胞中UHRF1蛋白的表达水平在经500和1 000 mmol/L AZD2014处理后显著下降，且浓度为1 000 mmol/L 时最明显，但10 和100 mmol/L 浓 度的AZD2014 对HCCLM3 细胞中UHRF1 蛋白的表达水平无明显影响，这和上述mRNA 表达实验结果是一致的。这更加进一步证明，mTOR 抑制剂AZD2014可能是通过降低肝癌细胞中UHRF1的表达来发挥抗肿瘤作用的。

图3 不同浓度AZD2014对肝癌细胞内UHRF1蛋白表达的影响

3 讨 论

mTOR 在体内主要以mTORC1 和mTORC2 两种形式存在，与肿瘤细胞的增殖能力密切相关，参与肿瘤的发生发展[9-10]。活化的mTORC1使4EBP1和S6K发生磷酸化，促进细胞内蛋白质的合成，进而提高细胞的增殖能力[11]；mTORC2 则可活化AKT 信号通路，参与细胞内多种生理过程[12]。然而，mTOR 信号通路异常激活阻碍细胞的分化，激发肿瘤的生成，加重肿瘤的恶化程度[13]。有研究表明，约一半的肝细胞癌患者存在mTOR 信号通路异常激活[14]。因此，针对mTOR 相关信号通路的药物研究对肝细胞癌的治疗具有重要意义。既往研究表明，mTOR 抑制剂除了本身具有抗肿瘤作用，还能使得肿瘤细胞对化疗药物更敏感[15-16]。近年来，研究者发现AZD2014是一种较好的mTOR 抑制剂，它不仅能较完全地阻断mTORC1信号，还能阻断mTORC2 信号，具有理想的抗肿瘤作用[6]。在本研究中我们发现，UHRF1可显著抑制肝癌细胞的增殖能力，但其具体作用机制尚不明确。

UHRF1是近年来发现的一个与肿瘤进展相关的核蛋白基因[17]，它通过与体内DNA甲基转移酶以及组蛋白去乙酰化酶等相互作用，参与调节DNA甲基化及染色质修饰等基因表达调控[18]，并调控体内抑癌基因的表达，从而影响肿瘤的进展[19]。我们既往的研究表明，UHRF1在肝细胞癌组织中的表达水平与肝癌患者的预后呈负相关，此外，敲低细胞中UHRF1的表达不仅可以显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭以及EMT 进程，还可以诱导肿瘤细胞出现细胞周期阻滞[20]。在本实验中我们发现，与对照组相比，经AZD2014处理后，肝癌HCCLM3细胞的增殖能力受到明显抑制，且AZD2014浓度越高，肝癌细胞增殖能力被抑制得更明显；同时我们还发现，经AZD2014处理后肝癌细胞内UHRF1的表达水平显著下降，因此，我们认为，mTOR 抑制剂AZD2014 可能是通过降低肝癌细胞中UHRF1的表达来发挥抗肿瘤作用的。当然，本研究仍存在一些不足，如未通过进一步实验来验证AZD2014是通过何种途径来影响UHRF1的表达等，仍需继续深入研究。

通过本研究我们发现，AZD2014可显著抑制肝癌细胞的增殖能力，且可显著降低肝癌细胞内UHRF1的表达水平，因此我们认为，AZD2014可能是通过抑制肝癌细胞内UHRF1的表达来发挥抗肿瘤作用的。