基于HPLC-Q-TOF-MS/MS技术的石见穿化学成分分析及其治疗胃癌的网络药理学探究

黄雯洁， 阮 帅， 温 芳， 王 惠， 鲁晓娜， 王玉兰， 胡 玥， 刘沈林， 舒 鹏

(1. 南京中医药大学附属医院， 南京 210000； 2.南京中医药大学药学院， 南京 210000)

1 引 言

石见穿系唇形科鼠尾草属华鼠尾草SalviachinensisBenth的干燥地上部分，别名华鼠尾草、紫参、小丹参、石打穿等.其性味苦、辛、平，归胃、肝、肺经，具有清热解毒、活血止痛、消肿散结的功效.民间主要用石见穿治疗噎嗝、痰喘、赤白带、痈肿、瘰疬等疾病[1].近年来石见穿作为抗肿瘤中药被广泛应用于各组方中，其各活性成分的抗肿瘤作用在肺癌[2]、肝癌[3]、胃癌[4]、肠癌[5]等多种恶性肿瘤被证实.现有研究已初步建立了石见穿的药物质量标准[6]，为进一步分析石见穿的有效化合物成分，阐明其药效物质基础，我们使用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术对石见穿水提物的主要化学成分进行了解析，提供了更为全面的石见穿水提物成分信息，以供明确其体内药效活性成分.

胃癌是临床常见的恶性肿瘤，根据2018年全球癌症统计数据，胃癌在全球肿瘤发病率中居第五位，死亡率居第三位[7].手术和化疗为胃癌主要治疗手段，然而其不良反应及毒副作用较为显著，且难以发挥长期抗肿瘤作用.中药具有多途径、多靶点、多环节、副作用小等优势，逐渐在肿瘤治疗中得到科研工作者的重视.石见穿在胃癌中的抗肿瘤疗效已经得到多项研究证实[8-9].因此，本文在对石见穿进行药效成分分析的基础之上，运用网络药理学研究方法，通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)、PubChem数据库、DisGeNET数据库等生物信息平台，从药物、化学成分、靶点、疾病间相互作用的整体性和系统性出发，探究石见穿治疗胃癌的作用机制.

2 材料与方法

2.1 材 料

石见穿药材来源于南京中医药大学附属医院中药房，购自安徽大别山中药饮片有限公司，批号：190601，产地：安徽，质量标准参照《中国药典》2015年版.经南京中医药大学药学院于瑞莲副教授鉴定为为唇形科植物华鼠尾草SalviachinensisBenth的地上部分.标本保存于南京中医药大学附属医院中心实验室.甲醇(TEDIA，批号18095056)、甲酸(江苏强盛功能化学股份有限公司，批号20160412)、乙腈(Merch，批号1.00030.4000).

Ultimate 3000高效液相色谱仪(1000 mm×1000 mmm×1000 mm)、SIL-20A XR UFLC仪(日本Shimadzu公司)、Triple TOF 5600 System-MS/MS高分辨三重四极杆飞行时间质谱仪(美国AB Sciex公司)、电子天平(天津天马衡基仪有限公司)SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵(南京文科仪器设备有限公司)、KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、PST-JY-10普力菲尔纯水机(上海富诗特仪器设备有限公司).

2.2 方 法

2.2.1 供试品制备 取干燥石见穿药材粉末1 g，精密称定，加10倍量双蒸水浸泡30 min，回流提取2次，第1次30 min，第2次20 min，合并两次滤液，70 ℃下旋转蒸发仪蒸干，用无水乙醇复溶至10 ml容量瓶中即可.

2.2.2 色谱条件 色谱柱为Hedera C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.1%甲酸水(B)-0.1%甲酸甲醇(C)，梯度洗脱 (0～7 min,97%～97% B；7～15 min，97%～50% B；15～20 min，50%～10% B；20～25 min，10%～97% B；25～37 min，97%～97% B)，流速1 mL·min-1，柱温30℃，进样量5 μL.DAD检测波长为260 nm.

2.2.3 质谱条件 电喷雾离子源负离子模式；质量扫描范围m/z 50～1 500；离子源温度550 ℃；气帘气流速40 L/min；雾化气流速55 L/min；辅助气流速55 L/min；喷雾电压-4 500 V；去簇电压-100 V.

2.2.4 数据处理 使用Peakview 2.0软件(美国AB SCIEX公司)，根据质谱数据中的一级质谱碎片信息及精确相对分子质量，结合拟合分子式、质量偏差范围(δ)≤5×10-6，初步预计可能的化合物，再通过比对SciFinder数据库、质谱碎片信息，结合参考文献对化合物进行结构鉴定.

2.2.5 胃癌疾病靶点及石见穿潜在活性成分筛选 在DisGeNET数据库中输入“gastric cancer”“ gastric carcinoma” “stomach cancer”“ stomach carcinoma”检索胃癌的相关靶点.

药物成分在体内经过吸收、分布、代谢和排泄过程到达靶器官发挥疾病治疗作用，口服生物利用度(OB)和类药性(DL)是中药成分参与体内过程的关键参数，可作为药物活性成分筛选指标[10].将液质联用解析鉴定所得的化学成分在TCMSP平台以OB和DL为参数进行筛选，为尽可能全面筛选，将条件设定为OB≥25%，DL≥0.05.

2.2.6 筛选石见穿治疗胃癌的潜在靶点 通过PubChem数据库，将筛选后的活性成分转化为SMILES结构式，将SMILES结构导入SwissTargetPrediction网站，对石见穿活性成分的所有潜在靶点进行预测.本研究中以每个SMILES结构预测靶点的Probabillity TOP20为标准进行筛选.将潜在活性成分的预测靶点与疾病靶点取交集，获得石见穿治疗胃癌的靶点集.

2.2.7 GO富集分析与KEGG通路富集分析 将石见穿治疗胃癌的靶点集导入DAVID数据库，限定物种为Homo sapiens，进行GO富集分析和KEGG通路富集分析.GO富集分析由生物过程(Biological process，BP)、细胞组分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)三个部分组成.本研究中GO分析及KEGG分析均以P<0.05作为筛选标准.

2.2.8 构建关键靶点“蛋白-蛋白相互作用”网络 将靶点信息导入STRING数据库，物种设置为Homo sapiens，进行靶点蛋白间的相互关联分析，导出文件中的node1、node2和组合分数(combined score)信息，以组合分数(combined score)≥0.4作为筛选条件，为尽可能全面探究蛋白相互作用关系，将“max number of interactors to show 1stshell”拓展为“no more than 10 interactors”.使用Cytoscape 3.7.1软件构建蛋白-蛋白相互网络(PPI)图，节点(node)的大小、形状变化和颜色深浅反应自由度(Degree)大小，自由度越大，则越表明该节点在网络中处于核心位置.

3 结果与分析

3.1 石见穿鉴定所得的化学成分信息

按照上述液相色谱和质谱条件对石见穿水提物样品进行分析，总离子流图(TIC)见图1，在正负模式下色谱峰均比较丰富.为了获得尽可能多的信息，本文采用正负两种离子的全扫描检测模式对石见穿的化学成分进行定性分析.根据TOF-MS质谱得到化合物的精确质荷比(m/z)，Product Ion二级质谱得到该质量数的二级碎片离子，并参考相关文献信息、结合化合物的化学键断裂规律，对石见穿所含化合物结构进行定性分析，鉴定得到48个化合物，绝大多数成分为酚酸类化合物、另有少量黄酮类、萜类有机酸、多糖类物质等.详见表1.

3.1.1 酚酸类 石见穿中含有大量酚酸类物质，为水溶性化合物，具有较强的药理活性，是石见穿的最主要有机成分之一.研究根据文献及数据库从石见穿中鉴定得到的主要酚酸类物质包括：丹参素(Danshensu)、原儿茶酸(Protocatechuic acid hesoxide)、原儿茶醛(Protocatechuic aldehyde)、丹参素葡萄糖(Danshensu-Glc)、绿原酸(Chlorogenic acid)、香豆酸(Coutaric acid)、迷迭香酸(Rosmarinic acid)、丹酚酸A(Salvianolic acid A)、丹酚酸J(Salvianolic acid J)、丹酚酸B(Salvianolic acid B)、丹酚酸C(Salvianolic acid C)、迷迭香酸甲酯(Methyl rosmarinate)、1-咖啡奎宁酸(1-Caeoylquinic acid)、4-咖啡奎宁酸(1-Caeoylquinic acid)、咖啡酸(Caffeic acid)、咖啡酸葡萄糖(Caffeic acid-Glc)、阿魏酸(Ferulic acid).

图1 正(A)负(B)离子模式下的总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram in positive (A) and negative (B) ion mode

酚酸类物质结构解析以峰Rt3.39 min、峰Rt30.461 min、峰Rt31.82 min为例，通过对保留时间、碎片离子信息及参考文献对照，确定其分别为丹参素(Danshensu)、丹酚酸B(Salvianolic acid B)及迷迭香酸(Rosmarinic acid).①保留时间为3.39 min，获得m/z 197.045 6[M-H]-的准分子离子峰，根据数据库匹配出的分子式为C9H10O5，精确分子量误差为0.3ppm，根据文献[11]初步判定该峰为丹参素，二级质谱图见图2A.二级质谱图中，此物质在m/z197处产生大量的[M-H]-离子，并呈现m/z179[M-H-H2O]-和m/z135[M-H-H2O-CO2]-碎片离子，切合丹参素存在芳环上的邻羟基,极易脱去一分子H2O后再脱去一分子CO2产生的特性.②保留时间为30.461 min，获得m/z359.075 56[M-H]-的准分子离子峰，根据数据库匹配出的分子式为C18H16O8，精确分子量误差为-1.6 ppm，根据文献[27]判定该峰为迷迭香酸(Rosmarinic acid)，二级质谱图见图2B，m/z197为其母离子丢失一分子咖啡酸形成，另外可见丹参素的特征碎片m/z179、m/z135、m/z123.③保留时间为31.82 min，呈现m/z717.1443[M-H]-的准分子离子峰，匹配分子式为C36H30O16，精确分子量误差为-2.5 ppm，结合文献[13]判定该峰为丹参素的多聚体丹酚酸B(Salvianolic acid B)，二级质谱图见图2C，其结构中含有2个丹参素片段，分别失去一分子和两分子丹参素得到碎片离子m/z519[M-H-C9H10O5]-和m/z321[M-H-2(C9H10O5)]-，少数m/z519发生麦氏重排，失去180Da，得到碎片m/z339，随后侧链断裂，产生碎片m/z295，继而再失去一分子H2O，产生碎片m/z 277.同理鉴定得到丹酚酸A(Salvianolic acid A)、丹酚酸J(Salvianolic acid J)、丹酚酸C(Salvianolic acid C)等酚酸类成分.

图2 丹参素(A)、迷迭香酸(B)、丹酚酸B(C)及山奈酚(D)的二级质谱图

3.1.2 黄酮类 黄酮类化合物在质谱中易于电离，碎片信息丰富，一般都具有C6-C3-C6的基本母核结构，本研究在石见穿中鉴定得到的黄酮类物质主要有：山奈酚(kaempferol)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、芦丁、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷及山奈酚-3-O-葡萄糖苷.

黄酮类物质结构分析以峰Rt35.52 min为例，保留时间35.52 min，获得准分子离子峰m/z287.0551[M+H]+，根据数据库匹配出的分子式为C15H10O6，精确分子量误差为0.3 ppm，通过对保留时间、碎片离子信息及参考文献[14]对照，初步鉴定为山奈酚(kaempferol)，二级质谱图见图2D，主要离子碎片m/z153[M+H-C8H6O2]+是由准分子离子m/z287.0551[M+H]+C环上RDA裂解形成，m/z121 [M+H-C8H6O2-CO2]+由母离子m/z 153脱去一CO2产生，另外质谱中可见其他离子碎片m/z213、m/z165、m/z157、m/z137、m/z135等，与文献报道一致.同理鉴定得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷、芦丁、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷及山奈酚-3-O-葡萄糖苷等黄酮类成分.

3.1.3 其他 另外，石见穿中还鉴定出了萜类有机酸，包括羟基积雪草酸(madecassic acid)、五灵脂三萜酸(goreishic acid)、积雪草酸(asiatic acid)、阿江榄仁酸(Arjunolic acid)；香豆素类成分，包括6-羟基香豆素(6-Hydroxycoumarin)、8-羟基香豆素(8-Hydroxycoumarin)、7-羟基香豆素(7-Hydroxycoumarin)等以及氨基酸类物质如色氨酸(tryptophan)等.

3.2 石见穿活性成分及治疗胃癌靶点分析

3.2.1 胃癌靶点及石见穿潜在活性成分筛选 经DisGeNET库检索(根据Uniprot ID号删除重复靶点)共得到3770个胃癌疾病靶点，计算sore gad的平均值，筛选出sore gad≥0.049552的疾病靶点共740个.将液质联用解析鉴定结果在TCMSP数据库检索及条件筛选后，共得到9个具有良好生物学活性的化合物，具体见表2.

表2 石见穿体内活性成分表

3.2.2 石见穿活性成分治疗胃癌的潜在靶点分析 将石见穿活性成分每个SMILES结构预测靶点的Probabillity TOP20作为潜在活性成分的预测靶点与胃癌疾病靶点取交集，共获得石见穿活性成分治疗胃癌的潜在靶点18个，具体见表3.

3.2.3 GO富集分析与KEGG通路富集分析 GO富集分析结果表明，石见穿在胃癌治疗中共涉及到48个生物过程(BP)，8个细胞组分(CC)以及27个分子功能(MF).

生物过程方面，石见穿主要对药物反应(Reponse to drug)、细胞药物反应(Cellular response to drug)、细胞流体剪切应力反应(Cellular response to fluid shear stress)、蛋白质分解代谢过程的负调控(Negative regulation of protein catabolic process)、胚胎植入(Embryo implantation)、一氧化氮生物修复

表3 石见穿活性成分治疗胃癌的靶点

过程的正调控(Positive regulation of nitric oxide biosunthetic process)、胶原分解代谢过程(Collagen catabolic process)、对雌激素的反应(Response to estrogen)等生物过程进行调节.

细胞组分方面，石见穿对质膜(Plasma membrane)、细胞质(Cytosol)、基底外侧质膜(Basolateral plasma membrane)、细胞质核周区(Perinuclear region of cytoplasm)、蛋白质细胞外基质(proteinaceous extracellular matrix)、顶端质膜(Apical plasma membrane)、细胞核(Nucleus)、细胞外隙(Extracelluar space)的作用较为显著.

分子功能方面，石见穿主要通过对酶结合(Enzyme binding)、蛋白结合(Protein binding)、锌离子结合(Zinc ion binding)、RNA聚合酶II转录因子活性和配体激活的序列特异性DNA结合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity,ligand-activated sequence-specific DNA binding)、ATP酶活性与物质跨膜运动(ATPase activity,coupled to transmembrane movement of substances)、相同蛋白结合(Identical protein binding)、异种运输ATP酶活性(Xenobiotic-transporting ATPase activity)、芳香酯酶活性(Arylesterase activity)、金属内肽酶活性(Metalloendopeptidase activity)等分子功能发挥胃癌治疗作用.

KEGG通路富集分析结果表明，除去与胃癌无关通路，石见穿在胃癌治疗中共涉及8条通路.富集潜在靶基因排名前五的通路依次为肿瘤通路(Pathways in cancer)、粘附连接(Adherens junction)、雌激素信号途径(Estrogen siganaling pathway)、ABC转运体(ABC transports)、肿瘤微小RNA(MicroRNAs in cancer).

使用R语言将GO分析与KEGG分析结果(按p值升序排列TOP10)分别绘制成气泡图，图中气泡大小代表富集基因数的多少，气泡颜色差异代表靶基因富集的显著性大小(见图3).

图3 GO富集分析与KEGG通路富集分析气泡图Fig.3 Bubble diagram of GO analysis and KEGG analysis

3.2.4 “蛋白-蛋白相互作用”网络的构建 蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络图中共包含节点(node)35个，边(edge)150条，平均节点度(average node degree)为8.57，平均局部聚类系数(avg. local clustering coefficient)为0.65，PPI丰度P值(PPI enrichment p-value)<1.0e-16.本文通过将“max number of interactors to show 1st shell”设为“no more than 10 interactors”以拓展探究蛋白相互作用关系，结果显示处于核心位置Top5的靶点为EGFR(23)、CDH1(20)、CTNNB1(19)、PTGS2(19)、EGF(18)，提示其在PPI网络中发挥着关键作用.(见图4).

图4 石见穿治疗胃癌靶点的PPI图Fig.4 PPI map of targets of Salvia chinensis in the treatment of gastric cancer

4 讨 论

利用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术可以得到高分辨率、高精度的质谱数据，根据化合物的结构及其裂解途径并结合文献数据，可较准确的定性相关化学成分，因此，HPLC-Q-TOF-MS/MS应用于化合物结构鉴定可为中药多组分鉴定研究提供可靠依据，且具有广阔的应用前景[35].本实验中质谱同时结合正负两种离子模式，均可采集到较丰富的色谱峰，为石见穿水提物样品的准确定性鉴定奠定基础.一级质谱是准确推测化合物分子结构必要的数据，本研究在基于一级质谱采集良好性基础上，并对二级质谱条件进行优化，再结合化合物相关裂解规律及文献，从而对石见穿鉴定出大量酚酸类、黄酮类等48个化合物成分.本研究实现了对石见穿水提物成分的快速定性分析，该方法快速、简便、灵敏度高，为石见穿质量控制、药理作用、临床应用等研究奠定基础.

现有文献已表明了石见穿在抗肿瘤方面的卓越效果[36]，本研究对其水提物进行成分解析，分析得到48种化学成分，为现有石见穿成分研究中解析最为全面、所得成分最多的研究.同样，在我们的研究中，也发现了石见穿中较具有代表性的几种抗肿瘤成分，如丹参素、迷迭香酸、山奈酚等.与此同时，石见穿也是本研究团队治疗胃癌临床效方“健脾养胃方”中的主要抗肿瘤药物.健脾养胃方由首届全国名中医刘沈林教授根据胃癌“脾虚毒瘀”的基本病机，通过二十多年的临床实践所创制的.其通过一项历时8年、纳入病例489例、有9个协作单位参研的多中心大样本国家中管局行业专项课题研究[37]，证实在进展期胃癌术后协同化疗，与单纯化疗相比，可使复发转移风险下降32.8%(P=0.004 2)；尤其对于胃癌Ⅲ期患者，复发转移风险更是下降了34.7%(P=0.007 2).本方治疗胃癌临床疗效显著，石见穿作为组方中的重要抗肿瘤药物，其治疗胃癌的活性成分、作用靶点机制有待发掘.因此，在对该药药学分析基础上，我们运用网络药理学研究方法，筛选出9个具有良好生物学活性的化合物，以胃癌治疗为研究对象，获得了石见穿活性成分治疗胃癌的18个潜在靶点，常见重要靶点例如EGFR、CDH1、CTNNB1、PTGS2、EGF等，这些靶点在PPI图中均位于核心位置，是连接多蛋白相互作用的重要基因.其中，EGFR家族对胃癌发生发展的调控已得到广泛研究，胃癌以异质模式过表达HER，尤其是EGFR和HER2，其在胃癌的细胞增殖和迁移中具有关键作用[38].以迷迭香酸类似物为代表的多种中药成分，可降低胃癌细胞中EGFRmRNA表达，抑制胃癌细胞的增殖和迁移，并诱导其凋亡[39].EGF[40]作为上游通路可促进胃癌细胞迁移，以EGF-Grb2-DENND1A-Rab35信号通路与DENND1A和Grb2的相互作用可以调控胃癌细胞的迁移和侵袭.在石见穿治疗胃癌的通路方面，KEGG富集分析预测了8条潜在通路，其中，粘附连接、ABC转运体为我们熟知的肿瘤调控重要通路.粘附连接途径包括了CREBBP、EP300、CDH1、CTNNB1、EGFR、MET、TGFBR2和ERBB2等多基因调控.Ge等[41]通过对78例进展期胃癌患者组织的全基因组测序，分析发现在粘附连接途径中具有一个或多个突变的患者具有更好的总体生存率.ABC转运体是与胃癌多药耐药密切相关的膜转运蛋白超家族，其最主要蛋白为ABCB1，此外还有ABCC1/ABCC2蛋白以及ABCG2蛋白，抑制这些蛋白表达可有效降低化疗药物在细胞内的外排，直接降低耐药的发生[42].

然而石见穿药物成分复杂，抗肿瘤机制亦趋于多方面多维度，本研究仅为该药成分的定性分析鉴定及通过网络药理学数据平台对其治疗胃癌潜在靶点的预测.对于不同成分的含量分析、药物活性分析及中药用药的毒理性分析尚待后续代谢组学等的进一步研究[43]，并通过体内外实验验证其作用靶点及通路机制，阐明其对胃癌的治疗作用，为石见穿更广泛的临床应用提供科学的实验依据.