蛋黄油的提取及其氧化产物挥发性成分分析

陈伊凡 唐宏刚 李欢欢 张 晋 朱冬荣 姚云昕 陈黎洪,*

(1 浙江省农业科学院食品科学研究所，浙江 杭州 310021； 2 浙江艾格生物科技股份有限公司，浙江 长兴 313100)

蛋黄油(yolk oil)通常是以鸡蛋黄为原料，经过提取分离制得的红棕色油状液体，低温时凝固成棕黄色固体。蛋黄油富含磷脂、脂肪酸、胆固醇、高密度脂蛋白和维生素等，营养价值丰富[1]。蛋黄油还具有良好的药理活性，如抗氧化、降血脂和促进创伤修复等[2-4]，传统医学将蛋黄油用于治疗烧烫伤、冻伤以及消化道疾病等[5-6]。此外，蛋黄油因富含卵磷脂和不饱和脂肪酸等也被广泛应用于食品、保健品和化妆品等领域[7-8]。

蛋黄油的制备方法主要有溶剂提取法、超临界CO2萃取法和酶法等。溶剂提取法主要用丙烷、氯仿、乙醇等溶剂提取，但丙烷提取的蛋黄油中磷脂含量较低[9]，氯仿本身具有一定毒性，因此以乙醇提取法最为常用，该方法成本低，适宜大量生产但存在溶剂残留、得率低等问题[10]。超临界CO2萃取法的研究大多在实验室进行，这种方法得率高且无污染，但对设备要求高且成本相对昂贵，因而难以大规模工业化生产[11-13]。也有研究将超临界CO2萃取与醇提法相结合提取蛋黄油[14]。酶法是一种提取油脂的新方法，工艺简单，污染率小，但这种方法得到的提取物主要由中性甘油三酸酯构成，脂肪酸组分含量较高[15-16]。而干馏法、蒸馏法等得到的产物由于需要高温制备，且易产生致癌物苯并芘[5]，具有一定安全隐患，不适宜规模化生产。

商品蛋鸡由于在产蛋末期的产蛋率严重下降而被淘汰，淘汰蛋鸡屠宰后通常会遗留许多卵泡。目前，由于卵泡回收机制与深加工技术缺失，卵泡的内在附加值未得到充分利用。然而卵泡与蛋黄十分类似，含有丰富的营养素，如磷脂、类甾醇、多不饱和脂肪酸等[17-18]，因此如果将卵泡加以利用不仅可以提升蛋鸡副产物卵泡的附加值，而且有利于保护环境和节约资源。

浙江省农业科学院食品科学研究所畜产品加工课题组前期研究了卵泡中卵磷脂的高效提取[19]以及胆固醇脱除技术[20]。本试验在前期研究的基础上进一步提取低胆固醇蛋黄油，从而建立卵泡中系列活性物质的绿色联提技术。同时在预试验过程中发现提取产物具有独特的香气，尤其在加热过程中产生浓郁的蛋黄香味。因此，将该蛋黄油进行一定的氧化调控来丰富其香气成分，提高风味品质，这在调味料和风味食品配料中具有极大的应用潜力。但目前关于鸡蛋挥发性成分的研究主要集中在全蛋、蛋黄或蛋清上[21-25]，对蛋黄油的风味研究较少。因此，本研究结合前期建立的氧化调控制备香精配料技术，并将提取的卵泡蛋黄油进行氧化调控并通过气相离子迁移色谱(gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS)测定其挥发性成分，以期明确氧化蛋典油的风味组成，提高其在食品领域的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡卵泡，购于本地农贸市场，平均重量为7.5 g，真空冷冻干燥后粉碎放入-18℃备用。β-环糊精，江苏丰园生物技术有限公司；无水乙醇(分析纯)，上海凌峰化学试剂有限公司。鸡卵泡的基本成分测定结果见表1。其中水分含量测定参照GB 5009.3-2016[26]，蛋白质含量测定根据GB 5009.5-2016[27]，脂肪含量测定参照GB 5009.6-2016[28]，灰分含量测定参照GB 5009.4-2016[29]，磷脂含量测定按照GB/T 5537-2008[30]。

表1 鸡卵泡的基本成分Table 1 Basic components of follicles

1.2 仪器与设备

ALB-224 型电子分析天平，赛多利斯学科仪器(北京)有限公司；DF-101S磁力搅拌器，上海力辰西邦仪器科技有限公司；DK-S26 型数显恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；LXJ-IIB型低速离心机，上海安亭科学仪器厂；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器；DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；Flavour Spec气相离子迁移谱风味分析仪，德国G.A.S 公司；Scientz-18N冷冻干燥机，宁波新芝冻干设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 卵泡中蛋黄油的提取工艺 参照文献[19-20]的提取工艺，先称取一定量的鸡卵泡加入95%乙醇(m∶v)，恒温25℃磁力搅拌25 min后，4 800 r·min-1离心20 min，上层滤液为卵磷脂，收集滤渣自然晾干后加适量水稀释搅拌，升温至60℃后加入β-环状糊精(卵泡质量的15%)搅拌1 h，冷却至5℃后4 800 r·min-1离心25 min，所得沉淀为胆固醇，上层滤液为含蛋黄油的卵泡液。将上层滤液置于旋转蒸发仪浓缩至表面无水分，加入一定体积的无水乙醇，离心后恒温提取、旋蒸浓缩(乙醇回收利用)得到浓稠的蛋黄油液体，最后将蛋黄油置于烘箱中干燥，称重。 按照公式计算蛋黄油得率：

(1)

式中，M为浓缩至无水分的卵泡液提取前的总质量，g；m为提取后浓缩干燥的蛋黄油质量，g。

1.3.2 单因素试验 分别以提取时间1 h、料液比1∶10、 无水乙醇、提取温度80℃为固定水平，考察各因素水平对蛋黄油得率的影响。其中，温度分别设为65、70、75、80、85℃，时间设为45、50、55、60、65 min，料液比设为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，乙醇浓度设为75%、80%、85%、90%、95%。

1.3.3 正交试验 为研究各因素对蛋黄油提取效果的综合影响，在单因素试验基础上，设定提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)和乙醇浓度(D)为考察因素，以蛋黄油得率为评价标准，采用L9(34)正交试验分析法分析各因素对提取工艺的影响，确定蛋黄油提取的最佳工艺条件。试验因素水平见表2。

测定最优工艺条件下蛋黄油的基本成分，其中游离脂肪酸测定参照GB 5009.168—2016[31]。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

1.3.4 蛋黄油的氧化 将经最佳提取工艺提取后经过旋蒸浓缩的低胆固醇蛋黄油装入加有电动搅拌器、温度计、空气导入管和回流冷凝器的容器中，当油浴温度达到110℃左右时通入空气，进行氧化反应。反应2.5 h后，制得氧化蛋黄油。

1.3.5 蛋黄油和氧化蛋黄油的挥发性成分测定 将顶空进样瓶中的样品进行孵化，使用加热的进样针抽取瓶内的顶空组分，采用GC-IMS分析其挥发性组分。

测定条件：顶空孵化温度60℃；孵化时间15 min；孵化转速500 r·min-1；顶空进样针温度85℃；进样量500 μL，不分流模式；清洗时间0.50 min；载气为高纯氮气(纯度≥99.999%)；色谱柱温度60℃；色谱运行时间20 min，设置程序流速2.00 mL·min-1并保持2 min，在20 min内线性增至100.00 mL·min-1。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel 2013制图。氧化蛋黄油测试数据采用仪器配套的LAV(laboratory analytical viewer)分析软件进行定量分析，GC-IMS Library Search通过内置的NIST 数据库和IMS 数据库对特征风味物质进行定性分析。LAV 中的Reporter 和Gallery Plot插件用于比较不同样品间挥发性有机物的图谱差异；Dynamic PCA插件用于样品的聚类分析以及快速确定未知样品的种类。采用LAV 软件的插件Matching matrix 进行相似度分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 提取温度对蛋黄油得率的影响 由图1可知，当提取温度介于65～80℃之间时，蛋黄油得率随着温度的升高而增加；当提取温度高于80℃后其得率下降，推测温度过高可能使蛋黄油中的一些脂类成分发生分解[32]。因此，提取温度控制在80℃以下为宜。

图1 提取温度对蛋黄油得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield rate of yolk oil

2.1.2 提取时间对蛋黄油得率的影响 由图2可知，当提取时间介于45～55 min之间时，蛋黄油得率随提取时间的延长而增大；之后随着提取时间的延长蛋黄油得率略微下降并趋于稳定。为节约成本和提高经济效益[33]，提取时间应控制在55 min左右。

图2 提取时间对蛋黄油得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the yield rate of yolk oil

2.1.3 料液比对蛋黄油得率的影响 由图3可知，蛋黄油得率随料液比的增大而上升，当料液比为1∶12时，得率大幅度提高。

图3 料液比对蛋黄油得率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield rate of yolk oil

2.1.4 乙醇浓度对蛋黄油得率的影响 由图4可知，蛋黄油得率随乙醇浓度增加而增加，当乙醇浓度为95%时蛋黄油得率达到最大。蛋黄油主要是脂溶性成分，易溶于有机溶剂，因此随着乙醇浓度的增加，提取剂的性质与蛋黄油相似度增加，提高了蛋黄油得率。

图4 乙醇浓度对蛋黄油得率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield rate of yolk oil

2.2 正交试验结果分析

由表3可知，对蛋黄油得率影响最大的因素是乙醇浓度，其次是提取时间和料液比，影响最小的是提取温度。蛋黄油提取最佳工艺条件为A2B2C2D2，即提取温度80℃、提取时间55 min、料液比1∶10、乙醇浓度95%，此工艺下所得蛋黄油的基本成分见表4。

表3 正交试验结果与分析Table 3 L9(34) orthogonal experimental results and statistical analysis

表4 蛋黄油的基本成分含量Table 4 Basic components of yolk oil

2.3 蛋黄油和氧化蛋黄油的风味物质定性分析

主成分分析(principal components analysis，PCA)是一种用于将样品聚类分析，以及快速确定未知样品种类的方法[34]。由图5可知，蛋黄油和氧化蛋黄油的风味差异极大，可以很好地聚为两类。第一主成分(PC1)的贡献率为93%，第二主成分(PC2)的贡献率为5%，PC1与PC2的贡献率之和为98%，说明对原始数据进行线性变换后，核心成分得到了有效的保留，能够反映出样本的总体特征。蛋黄油和氧化蛋黄油的主要差异在第一主成分。而且从图6可以看出，蛋黄油中含有的挥发性物质组成较单一，而氧化蛋黄油中的挥发性成分明显更多。

图7是蛋黄油和氧化蛋黄油的GC-IMS图(俯视图)，纵坐标表示保留时间，横坐标表示离子迁移时间(归一化处理)，红色垂直线表示反应离子峰(RIP峰，归一化处理)，RIP 两侧的每个点代表一种挥发性有机物，颜色代表物质的浓度，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高，颜色越深表示浓度越高，不同化合物可能由于浓度原因以单体或二聚体形式存在。通过比较保留时间和漂移时间，并从GC-IMS 库进行匹配从而对挥发物质进行定性。由图7可知，样本的特征挥发性组分能通过GC-IMS 技术很好地分离，特征谱表明蛋黄油中乙醇含量较高，且几乎不含有其他挥发性成分；而氧化蛋黄油含有的挥发性成分和蛋黄油相比差异较大。

图5 蛋黄油和氧化蛋黄油的PCA图Fig.5 PCA analysis of yolk oil and oxidized yolk oil

图6 蛋黄油和氧化蛋黄油的GC-IMS三维谱图Fig.6 Three-dimensional GC-IMS images of characteristic flavor of yolk oil and oxidized yolk oil

图7 蛋黄油和氧化蛋黄油的GC-IMS谱图(俯视图)Fig.7 Two-dimensional GC-IMS images of characteristic flavor of yolk oil and oxidized yolk oil

为明确对比两类型蛋黄油中具体的差异物质，选取所有峰进行指纹图谱对比(图8)。图8中每一行代表一个蛋黄油样品中选取的全部信号峰，每一列代表同一挥发性化合物在不同蛋黄油样品中的信号峰，由此可对每种样品的完整挥发性化合物信息以及样品之间挥发性有机物的差异进行分析。因蛋黄油样品的风味物质未检出，表5只显示了氧化蛋黄油的风味物质定性结果。氧化蛋黄油共检出26种挥发性物质，其中11种未鉴定出，定性分析后识别出15种挥发性物质，包括4种醇类、3种醛类、2种酮类、2种酯类和1种呋喃，其中苯乙酮、1-己醇和5-甲基-2-呋喃甲醇含二聚体。

3 讨论

本研究结果表明，蛋黄油和氧化蛋黄油中的挥发性有机物差异较大，氧化蛋黄油中的风味物质较多，而蛋黄油中的乙醇含量高，其他风味物质较少。由于在通空气氧化的工艺中需搅拌蛋黄油，该步骤需要蛋黄油有一定的流动性，因此前一步提取的蛋黄油中乙醇未旋蒸彻底，其残留在一定程度上影响了分析。蛋黄油在氧化过程中会发生脂肪氧化分解反应，其产物具有浓郁的蛋黄香味，在风味香精、食品配料加工中具有应用价值。醛类物质由于阈值低，是重要的香气成分。早期研究认为2-甲基丁醛、2-甲基丙醛等醛类是蛋黄加热后的主要挥发性组分[35-36]。Matiella等[37]分离鉴别出炒鸡蛋中的醛、酮、醇等挥发性化合物，并发现3-甲基丁醛(异戊醛)是其中重要的风味物质。类似的，本研究发现，3-甲基丁醛含量丰富，是构成氧化蛋黄油香气轮廓的重要风味物质，其能产生麦芽味、焙烤及水果香味。除3-甲基丁醛，己醛等醛类也丰富了氧化蛋黄油的香气。醇类一般由脂肪氧化产生[38]，对风味的贡献不大，氧化蛋黄油中有1-己醇、2,3-丁二醇、5-甲基-2-呋喃甲醇等醇类物质。蛋黄油脂中的挥发性酮类成分主要源于油酸、亚油酸等的分解氧化[39]，本研究分析表明在氧化蛋黄油中含有较多的2-丁酮(清香味)。氧化蛋黄油中还含有苯甲醛，苯甲醛属于芳香族化合物，含有特殊的杏仁味且阈值低。有研究表明苯甲醛在咸鸡蛋蛋黄中是一种重要的挥发性物质[40]；还有研究表明，己醛、乙酸丙酯、2-戊基呋喃等是蛋黄的关键气味活性物质[41]。在本研究中，乙酸丁酯、己醛(青草味)、2-戊基呋喃、芳樟醇(铃兰香气)等也为氧化蛋黄油的风味做出了贡献。

图8 蛋黄油和氧化蛋黄油的Gallery Plot图(指纹图谱)Fig.8 Fingerprints information of characteristic flavor of yolk oil and oxidized yolk oil

表5 氧化蛋黄油的特征风味物质定性分析信息Table 5 Qualitative information of characteristic flavor of oxidized yolk oil

4 结论

为提高蛋鸡副产物的利用价值，本研究从鸡卵泡残渣中提取出蛋黄油并进行氧化风味调控。结果表明，卵泡蛋黄油提取的最优工艺参数：提取温度75℃，提取时间55 min，料液比1∶10，乙醇浓度95%。用GC-IMS对氧化蛋黄油的特征风味成分进行分析，发现其主要风味物质包括3-甲基丁醛、2-丁酮、己醛、苯甲醛、2-戊基呋喃等，其中3-甲基丁醛是特征风味物质。卵泡具有较高的开发价值，提高蛋鸡副产物的利用水平能更好地提升蛋品的附加值，对行业发展具有积极作用。