崇明西红花根际土壤和球茎微生物多样性分析

周 琳 杨柳燕 蔡友铭 张 雪 张永春,*

(1 上海市农业科学院林木果树研究所, 上海 201403；2 上海华宇西红花种植专业合作社, 上海 202150)

西红花(CrocussativusL.)，又名番红花、藏红花，是鸢尾科番红花属中具有药用价值的多年生草本植物[1]。西红花花丝(花柱和柱头)作为传统中药具有活血化瘀、凉血解毒、消肿止痛、解郁安神等功效[2]，其特有的次生代谢产物，藏红花素、藏红花醛、藏红花酸等[3]，具有抗肿瘤、抗炎、降血糖和血脂等功能[4]。除了药用价值，西红花还广泛用于食品、饮料、汤料、香料、化妆品的着色和调味。因此，西红花既是国内外市场紧缺的名贵中药材，又是重要的日用化工、食品香料原料，具有较高的经济价值。

西红花原产于伊朗、西班牙、希腊等国家，目前在伊朗、西班牙、印度、日本、巴基斯坦等国家均有种植[5]。我国西红花多从日本和德国引进，现已在上海、浙江、北京、福建等地有一定栽培规模。上海崇明较早地引进和种植西红花，经过30多年的栽培体系的摸索，已辐射华东地区近133 hm2[6]。西红花原产地气候多冷凉干燥，符合其生长习性，多年连续栽培，整个生长期(越夏、采花和越冬)均在田间[7]。然而，由于江浙沪地区夏季温度和湿度较高，西红花露地越夏期间病害发生严重，因此对西红花种植方式进行了改良，形成了“二段式”栽培方式，即室内培育采花(6月至11月)和田间种球繁育(12月至次年5月)两个阶段[7-8]。研究表明，西红花球茎与开花、新球茎形成和功能成分含量密切相关[7]。国内外多关注于西红花栽培体系的优化和种球繁育，而在西红花生产中，球茎腐烂病已造成西红花产量和品质下降[7]，因此其致病菌的分离鉴定及其防治药物的筛选逐渐受到国内外关注[9-12]。

西红花属于喜肥植物，在种植前使用大量的有机肥，在生长期间需多次追肥，在崇明已形成了水稻-西红花轮作的模式。经过长期的种植，西红花栽培模式可能导致种植地土壤菌群多样性与其他栽培地存在较多差异，但目前鲜有相关的报道。近年来，西红花栽培企业和农户发现在西红花种植过程中有不同程度的腐烂病发生，严重影响西红花的产量和品质。因此，本试验利用Illumina MiSeq测序方法开展崇明西红花栽培地球茎和土壤微生物多样性研究，以期为深入了解土壤和球茎菌群群落和丰度，制定合理可行的土壤灭菌和球茎杀菌方案和降低西红花腐烂病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集与处理

本试验于2016年12月开展，随机采集崇明岛庙镇4家西红花种植户的根际土壤和球茎，4家农户种植西红花均采用西红花-水稻轮作模式，栽培年限为6年。试验取样前，已连续2年按照当地西红花生产合作社的栽培技术规程进行西红花种植和水肥管理。在每个西红花种植户栽培地，均采用5点S形法挖取15～20 cm深度的土壤，取得的土壤去除西红花根系等杂质，将每个农户栽培地根际土壤混合为1个土壤样本，共4份土壤样本。取每个农户栽培地的健康且无病斑西红花球茎3个，共4份西红花球茎样本。土壤和球茎样本用冰盒保鲜带回实验室。

1.2 微生物多样性分析

1.2.1 西红花根际土壤和球茎中微生物总DNA的提取 参照Ambardar等[12]和Pang等[13]的方法。4份土壤样本均分别提取3次DNA，并提取每个西红花球茎微生物DNA。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测抽提出DNA的完整性，并利用Nanodrop 2000紫外可见分光光度计(Themo ScientificTM, Wilmington, DE, USA)检测DNA浓度和纯度，-80℃冻存高质量的DNA(A260/A280比值范围为1.8～2.0)。

1.2.2 PCR扩增和MiSeq测序 西红花根际土壤和球茎中细菌16S rRNA和真菌ITS序列的引物设计和PCR扩增由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。细菌16S rRNA基因扩增使用通用引物(520F和802R[14])；真菌基因扩增引物为ITS1F(5′-G G A A G T A A A A G T C G T A A C A A GG-3′)和ITS1R(5′-G C T G C G T T C T T C A T C G A T GC-3′)。细菌和真菌PCR反应体系和扩增程序相同，均参照牛世全等[14]的方法。同一样品均进行3次PCR，PCR扩增结束后，通过2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用Axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术有限公司，杭州)对切取目的片段进行回收。纯化后的PCR产物由上海派森诺生物科技有限公司利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)进行双端测序。

1.3 数据分析

首先采用滑动窗口法对双端序列进行质量初筛，然后利用FLASH软件(Version 1.2.7)[15]对通过质量初筛的双端序列进行拼接，最后运用QIIME软件(v1.8.0)[16]识别疑问序列，并通过QIIME软件调用USEARCH(v5.2.236)检查和剔除嵌合体序列。

使用QIIME软件[17]调用序列比对工具UCLUST[15]对上述获得的序列进行归并和OTU(operational taxonomic units)划分(按97%的序列相似度)，选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列。通过与Greengenes数据库(细菌)[18]和Unite数据库(真菌)[19]对比获得OTU分类学信息。利用QIIME软件[16]计算根际土壤和球茎中细菌和真菌的Alpha多样性，基于Ⅰ-Sanger生信云平台(https://www.i-sanger.com/)计算根际土壤和球茎中共有OTU数量，并绘制OTU-Venn图和两组间物种差异分析等。

2 结果与分析

2.1 西红花根际土壤和球茎中细菌和真菌的多样性分析

由表1可知，西红花根际土壤细菌和真菌的有效OTU数量分别为5 500和1 166，球茎细菌和真菌的OTU数量分别为433和300。根际土壤中细菌的ACE和Chao1丰富度指数分别为24 601和10 558，显著高于球茎，表明西红花根际土壤中细菌的群落丰富度高于球茎；根际土壤中真菌的ACE和Chao1丰富度指数分别为707和678，高于球茎，但两者差异不显著。根际土壤中细菌和真菌的Shannon多样性指数均高于球茎，而Simpson多样性指数均低于球茎，说明根际土壤中细菌和真菌的群落多样性高于球茎。此外，西红花根际土壤细菌和真菌组成较为丰富，而球茎中较少，其中根际土壤与球茎共有的细菌和真菌OTU数量分别为292和145，分别占球茎OTU总数的67.44%和48.33%；球茎中特有细菌OUT数量为141，特有真菌OUT数量为155(图2)。综上，西红花根际土壤和球茎在细菌和真菌的组成、结构及相对丰度上存在较大差异，且根际土壤的细菌和真菌群落的丰富度和多样性均高于球茎。

2.2 西红花根际土壤和球茎中细菌和真菌群落结构组成分析

由表2可知，西红花根际土壤和球茎中分别含有11和7个门类细菌菌群，二者细菌菌群丰度最高的均为变形菌门，分别为41.25%和42.06%。此外，酸杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门和Latescibacteria仅存在西红花根际土壤中，球茎中未检出。根际土壤和球茎中真菌均含有2个门类，分别为子囊菌门和担子菌门。其中，根际土壤中主要是子囊菌门，相对丰度达86.25%，担子菌门仅有2.40%；球茎中子囊菌门的相对丰度为39.85%，也明显高于担子菌门(7.11%)，但有53.03%未能分类。真菌统计显示，根际土壤和球茎中分别含有5和6个纲类真菌菌群。其中，根际土壤中丰度最高的为粪壳菌纲(63.49%)，其次为座囊菌纲(12.28%)和散囊菌纲(5.64%)，伞菌纲(1.58%)和锤舌菌纲(0.70%)相对丰度较小；球茎中优势菌群为散囊菌纲(25.90%)，其次为锤舌菌纲(8.70%)和外担菌纲(6.20%)，座囊菌纲(1.08%)和伞菌纲(0.84%)相对丰度较小。此外，外担菌纲不存在于西红花根际土壤中，只存在于球茎中，且相对丰度较高(6.20%)。

表1 西红花根际土壤和球茎中细菌和真菌的多样性指数Table 1 Diversity index of bacteria and fungi in rhizosphere soil and corm of saffron

图1 西红花根际土壤和球茎中细菌 和真菌OTUs-Venn图Fig.1 OTUs-Venn graph of rhizosphere soil and corm in saffron

由图2可知，从属水平进行分析，西红花根际土壤和球茎中细菌和真菌群落组成和相对丰度存在明显差异。西红花根际土壤中细菌群落主要为厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)中未鉴定出的菌属(10.33%)、酸杆菌属(Acidobacteria，5.36%)、硝化螺旋菌属(Nitrospira，2.80%)、芽单胞菌属(Gemmatimonadaceae，2.69%)和亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae)中未鉴定出的菌属(2.27%)；球茎中主要为蓝细菌纲(Cyanobacteria)中未鉴定出的菌属(13.74%)、假单胞菌属(Pseudomonas，12.20%)、放线孢菌属(Actinomycetospora，9.11%)、链霉菌属(Streptomyces，8.59%)和微杆菌属(Microbacterium，6.69%)，且糖多孢菌属(Saccharopolyspora)和假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)菌群仅存在于球茎中，在根际土壤中未检出。西红花根际土壤中真菌群落主要为裂壳菌属(Schizothecium，14.67%)、Myrmecridium属(8.83%)、柄孢壳属(Zopfiella，7.83%)、黄丝曲霉属(Talaromyces，5.47%)和柄孢壳菌属(Podospora，3.74%)；球茎中真菌与根际土壤明显不同，丰度最高的为青霉菌属(Penicillium，24.07%)，其次为背芽突霉属(Cadophora，8.68%)、外担菌属(Exobasidium，6.20%)和曲霉属(Aspergillus，1.73%)，其中背芽突霉属(Cadophora)和曲霉属(Aspergillus)在根际土壤中未检出。

2.3 西红花根际土壤和球茎中细菌和真菌种水平差异分析

通过Ⅰ-Sanger 生信云平台分析根际土壤和球茎中细菌和真菌在种水平上的差异表达。由图3可知，西红花根际土壤中细菌相对丰度显著高于球茎，在球茎中相对丰度极低，甚至未检出；而蓝细菌(Cyanobacteria)、链霉菌(Streptomyces)、芽孢杆菌(Bacillus)和糖多孢菌(Saccharopolyspora)在球茎中的相对丰度显著高于根际土壤，其中球茎和根际土壤的Cyanobacteria相对丰度分别为13.74%和0.16%，Streptomyces分别为8.26%和0.06%；球茎中芽孢杆菌、糖多孢菌的相对丰度分别是根标土壤的11.73和291.91倍。由图4可知，根际土壤和球茎中真菌在种水平上的差异表达与细菌规律相似，除了未分类的真菌，根际土壤中相对丰度较高的真菌在球茎中相对丰度基本低于0.001%，而球茎中相对丰度较高的真菌在根际土壤中的相对丰度基本低于0.013%。在球茎中大量检测到Penicillium、Penicillium_roseopurpureum、Penicillium_steckii、Exobasidium_sp和Cadophora，相对丰度分别为7.86%、7.07%、6.64%和6.20%和5.65%，而根际土壤中基本均为0.01%左右。此外，Cadophora仅在西红花球茎中检出。

表2 细菌门类水平及真菌门类、纲类水平上的组成及相对丰度Table 2 Relative abundances and composition of bacterial taxa at the phylum level, fungi taxa at the phylum and class level /%

图2 西红花根际土壤和球茎中细菌和真菌群落在属类水平上的组成及相对丰度Fig.2 Composition and relative abundances of bacterial and fungi taxa in rhizosphere soil and corm of saffron at genus level

图3 西红花根际土壤和球茎中细菌群落在种水平上的组成差异Fig.3 Compositional differences of bacterial taxa in rhizosphere soil and corm of saffron

图4 西红花根际土壤和球茎中真菌群落在种水平上的组成差异Fig.4 Compositional differences of fungal taxa in rhizosphere soil and corm of saffron

3 讨论

有研究表明，崇明东滩湿地土壤中真菌主要为子囊菌门和担子菌门，在纲水平上主要为粪壳菌纲、酵母菌纲和座囊菌纲，而伞菌纲和单子菌纲的多样性相对较低，细菌主要为放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门[20-21]。本研究中，崇明庙镇西红花根际土壤真菌主要为子囊菌门和担子菌门，在纲水平主要为粪壳菌纲和座囊菌纲，与黄斌[21]的研究结果一致；而本研究土壤细菌主要为变形菌门、绿弯菌门和酸杆菌门，这与崇明湿地土壤中细菌菌群结构存在较大差异。由此可见，西红花栽培地土壤菌群多样性与崇明其他栽培地存在一定的差异，这可能与西红花栽培过程中缺乏统一田间管理技术规程有关，部分栽培区存在过量施肥的现象，最终导致西红花栽培地土壤中细菌多样性与湿地土壤存在较大差异。

Ambardar等[11]研究了印度栽培地西红花不同生长时期土壤中真菌的变化，发现土壤中除了检测到子囊菌门和担子菌门外，还检测到接合菌门；在休眠期，接合菌门丰富(99.70%)，但在开花期几乎不存在(0.80%)，而担子菌门丰度从开花期的93.20%降至休眠期的0.05%。本研究以12月的西红花根际土壤为材料，取样时间接近开花期，但土壤中菌群以子囊菌门为主，说明西红花相同开花时期，不同栽培地之间菌群在门水平存在显著差异。研究表明，土壤中菌群群落和相对丰度受金属元素[21]、种植方式(间作、连作、轮作)[22-23]、物种[23]、肥料[23]等因素的影响较大。Ambardar等[11-12]证实了西红花栽培地土壤中菌群结构受西红花生长不同时期、土壤性质、栽培模式等因素共同影响。针对崇明西红花栽培地水稻-西红花轮作模式，在11-12月西红花种植前使用大量基肥，在12月至次年5月进行多次追肥的生产模式，进一步深入研究西红花不同生长时期土壤中菌群的变化，研究肥料类型以及施肥方法对崇明西红花栽培地土壤菌群时空变化，可为西红花种植前土壤的灭菌、西红花种球采收后的球茎消毒以及合理施肥提供理论依据。

西红花球茎腐烂病是当前生产中最常见、危害最严重的病害之一，严重影响西红花的产量和质量，其原因主要与土壤中菌群及球茎中内生菌有关[7]。研究表明，土壤中芽孢杆菌属是引起西红花球茎腐烂病的主要菌群[12]，而本研究中根际土壤中芽单胞菌属相对丰度仅为2.69%，所占比例较少，而在球茎中检测到其特有的Saccharopolyspora属和Pseudonocardia属菌群，且在种水平上球茎中Cyanobacteria、Streptomyces、Bacillus、Saccharopolyspora和Mitochondria的相对丰度比根际土壤高10倍以上，这些菌群有可能是导致崇明西红花球茎腐烂病的因素之一。除了土壤中的菌群，Wani等[9]认为西红花球茎中内生菌可能影响其生长、发芽、适应性，以及对病原体的抗性。因此，本研究开展了西红花球茎细菌和真菌的检测，结果显示，球茎中主要检测细菌和真菌在多样性明显低于根际土壤，与根际土壤中微生物在纲、属和种的组成和相对丰度均存在明显差异。此外，球茎中多个属和种水平的细菌和真菌相对丰度显著高于根际土壤，甚至部分属为球茎中特有的属，如Aspergillus属虽然在球茎中相对丰度低于2%，但其仅在球茎中检测到，而根际土壤中未检出。在细菌和真菌种水平的差异分析中，差异显著的种基本呈现根际土壤或球茎中所特有，即使部分种在土壤和球茎中均存在，但相对丰度差异极显著。

西红花腐烂病致病菌主要是青霉菌、炭疽菌、丝核菌、曲霉菌和尖孢镰刀菌等[7]。赵丽娟[24]以有腐烂病症状的西红花球茎为材料，进一步分离且证实了3株真菌为腐烂病主要致病菌，分别为曲霉属的巴西曲霉、镰刀菌属的尖孢镰刀菌和青霉菌属的桔青霉菌。2018年，Wani等[25]从西红花球茎中分离出担子菌潜伏病原体(命名为CSE26)，通过植株和田间试验证实CSE26可导致球茎腐烂，并发现CSE26产生的氯化芳香族化合物对拟南芥具有毒性，可能是CSE26致病的原因。Wani等[9]于印度14个不同西红花栽培地从休眠期和开花期球茎中分离出294个内生真菌，其中大量存在的为Phialophoramustea、Cadophoramalorum、Talaromycescellulolyticus和Penicilliumgriseofulvum。本研究从球茎真菌中也检测到Cadophora属，且在属水平相对丰度为8.68%。Cadophora属在西红花研究中尚未见报道，而该属真菌大多数从土壤和植物中分离出，其中Cadophoragregata引起了大豆褐腐病，对美国大豆产业造成了重大经济影响[26]；Cadophoramalorum导致猕猴桃枝干的腐烂[27]；从猕猴桃中分离出的Cadophoramelinii和Cadophoraluteoolivacea被认为会导致树干肥大和纵向树皮裂缝[28]。而Travadon等[29]认为Cadophora是葡萄藤腐烂和变色的主要真菌。因此，西红花球茎中Cadophora属真菌，除了Wani等[9]已报道的Cadophoramalorum外，同属真菌值得进一步分离、鉴定和验证。此外，本研究结果表明，西红花球茎中真菌与根际土壤中明显不同，相对丰度最高的为Penicillium属(24.07%)，在种水平则主要为Penicillium_roseopurpureum和Penicillium_steckii，这与Wani等[9,25]的研究结果一致，即西红花腐烂病等病害的发生，除了受土壤中菌群影响以外，可能与西红花球茎中微生物组成和丰度紧密相关，且其病害发生率与其微生物组成和丰度较为相关。

综上所述，本研究利用Illumina MiSeq测序对崇明西红花根际土壤和球茎中细菌和真菌多样性进行了分析，但不同肥料、施肥方式、施肥量、轮作模式等对西红花土壤和球茎不同生长期菌群的影响仍缺乏系统研究，需明确土壤菌群与球茎中菌群的相关性，针对西红花球茎腐烂病的主要细菌和真菌做进一步筛选验证，为西红花的合理施肥和病害防控提供理论依据。

4 结论

西红花根际土壤和球茎中细菌和真菌存在显著差异，根际土壤中细菌和真菌的丰富度和多样性明显高于球茎。西红花根际土壤和球茎中细菌和真菌在门类水平上菌群类别基本一致，其中除了变形菌门外，根际土壤和球茎中细菌和真菌门类相对丰度存在较大差异，在属和种水平上也存在较大差异。从细菌和真菌在种水平上差异性分析结果来看，西红花病害的发生可能与球茎中内生菌更相关，尤其是Phialophora和Cadophora。依据球茎中细菌和真菌的类别，合理利用杀菌剂开展西红花种球的消毒，对于降低西红花病害的发生具有重要意义。