高粱KNOX基因家族鉴定及SbKNOX22基因表达分析

陈 俊 方远鹏 蒋君梅 杨再福 任明见,2 李向阳 蒋选利,* 谢 鑫,2,*

(1 贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025；2 国家小麦改良中心贵州分中心，贵州 贵阳 550025； 3 贵州大学绿色农药与农业生物工程教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

同源异型盒基因家族(homeobox gene family)是一类含有同源异型盒结构域的转录调控因子[1]。根据该家族的结构特征和系统进化关系将其分为14类，该家族基因在调控植物生长和叶片发育过程中起着至关重要的作用，如在决定细胞的命运和生物体的形态建成等方面[2-4]。植物中第一个同源异型盒基因是在玉米(ZeamaysL.)中发现的Knotted1(Kn1)，该基因可以调节玉米叶鞘与叶片结合部位，导致细胞沿着侧脉不能够正常的分化[5]。KNOX(Knotted1-like homeobox)家族基因所编码的氨基酸属非典型同源异型盒蛋白，该家族广泛存在于各种植物中[2]，目前已在番茄(SolanumlycopersicumL.)[6]、大豆(Glycinemax)[7]、水稻(Oryzasativa)[8]、毛竹(Phyllostachysedulis)[9]和烟草(NicotianatabacumL.)[10]等植物中报道。KNOX家族蛋白具有KNOX1、KNOX2、ELK和Homeobox KN四个结构域[11]。根据KNOX家族基因的系统发育关系、基因结构特点及表达方式可将其分为Ⅰ类和Ⅱ类[12]。当KNOX与具有同源异型结构域的转录因子BEL相互作用时，形成复合体后可协助植物HOX蛋白控制细胞命运[13]。据报道，KNOXⅠ类基因在茎顶端分生组织中表达，在新生的叶原基中短暂表达后其表达量逐渐下调[14]。KNOXⅡ类基因在拟南芥(Arabidopsisthaliana)和番茄中，除分生组织外，在其余大部分组织中均可表达[15]，从而参与调控植物的生长发育；例如，蒺藜状苜蓿(Medicagotruncatula)的KNOXⅡ类基因KNOX4能够控制种子的生理性休眠[16]；拟南芥中KNOXⅡ类基因KNAT7在木质部的形成方面发挥作用[17]，而KNAT3和KNAT5 基因在根的发育中发挥作用，其表达受到根生长所需激素的调控，即乙烯增加KNAT5启动子结构域的活性，细胞分裂素降低KNAT3启动子的活性，进一步影响根的生长[18]。KNOX家族基因在茎顶端分生组织[19]和维管束的形成[20]等生长发育过程中发挥着重要的作用，同时KNOX基因可调控细胞分裂素、赤霉素和生长素的含量[21]，以及参与环境胁迫的应答，如麻疯树(Jatrophacurcas)JcKNOX1基因在低温逆境下其表达量增加[22]。

高粱[Sorghumbicolor(L.)Moench]作为一种重要的工业原料和饲料作物，对其KNOX转录因子进行鉴定及表达分析可为培育优良的高粱新品种提供理论支持。本研究在全基因组水平上对高粱KNOX家族基因进行系统性的注释、染色体定位分析、系统发育分析、基因结构分析和Motif分析，并对SbKNOX22基因在不同组织中的表达量，以及植物激素、干旱胁迫和盐胁迫处理后该基因的表达量进行了实时荧光定量PCR分析(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)，以期为探究该基因家族成员在高粱生长发育、信号转导和植物激素水平调控等方面奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 高粱品种及处理方法 试验用高粱BTx623种子由贵州大学植物病理教研室保存。将高粱种子在清水中浸种24 h，随后用滤纸保湿48 h催芽，取芽置于-80℃保存备用。将发芽的种子播种在灭菌营养土中，在25℃光照和黑暗各12 h交替的温室中培养至三叶期，分别取根、茎、叶组织；另将其幼苗根部分别浸泡在用水杨酸、氯化钠(NaCl)、PEG 6000和甘露醇处理过的营养液中，其处理浓度分别为1 mmol·L-1、250 mmol·L-1、 0.2 g·mL-1、300 mmol·L-1，分别于处理0、0.5、1、3、6、9、12和24 h取样，设置3个生物学重复，每个生物学重复处理5株，所取样品用液氮速冻，置于-80℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 异丙醇、无水乙醇购自天津市富宇精细化工有限公司；Water-DEPC Treated Water，水杨酸、盐胁迫和干旱胁迫处理剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；3 mol·L-1醋酸钠溶液、70%乙醇溶液购自北京酷来搏科技有限公司；反转录试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；SYBR荧光染料试剂盒购自北京康润诚业生物科技有限公司。

1.1.3 引物设计 高粱SbKNOX22的qRT-PCR正反向引物为SbKNOX22-qF：5′-G A C A A A C T T G T G G A T A T T C G GG-3′，SbKNOX22-qR: 5′-C T T G T C T T C C T C A G T T G G G T AT-3′；高粱内参基因SbEIF4a的qRT-PCR正反向引物为SbEIF4a-qF: 5′-A G G A T T G G C A C C A G A A G G GT-3′，SbEIF4a-qR: 5′-C A C A T C A A G C C C C T T G C A GA-3′，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.2 高粱KNOX基因家族鉴定、染色体及基因结构分析

通过Hmmer 3.0软件以拟南芥、水稻、番茄和大豆建立的比对序列徽标检索NCBI内高粱数据库，基于SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI-CD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)网站检测保守结构域；用ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)预测SbKNOXs蛋白的基本理化性质；根据Softberry(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)网站完成SbKNOXs蛋白的亚细胞定位预测。利用GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)及MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)网站对基因结构图及染色体定位情况进行分析。

拟南芥KNOX基因家族的序列来源于拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)，水稻、番茄和大豆KNOX基因家族的序列来源于Phytozome数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)。

1.3 高粱KNOX基因家族系统发育树及蛋白保守功能基序分析

利用MEGA 7.0软件，以邻接法(neighbor-joining，NJ；bootstrap=1 000)构建KNOX基因家族系统进化树，通过MEME(http://meme-suite.org/)在线网站对高粱KNOX家族蛋白的保守功能基序进行分析，使用Evolview美化进化树。

1.4 SbKNOX22基因表达分析

提取高粱植株总RNA，将其反转录为cDNA，以反转录cDNA为模板，利用qRT-PCR检测SbKNOX22基因的表达量，扩增体系包括cDNA 4.5 μL、SYBR Premix 7.5 μL、上下游引物各0.3 μL、灭菌去离子水补至15 μL。反应程序：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃复性15 s，72℃延伸20 s，40个循环；95℃ 10 s，65℃ 10 s，1个循环。设置3个技术重复。qRT-PCR数据使用 2-ΔΔCt方法进行分析。

2 结果与分析

2.1 高粱KNOX基因家族鉴定

为全面鉴定高粱KNOX基因家族成员，运用Hmmer程序依据拟南芥、水稻、番茄和大豆的KNOX家族全蛋白序列构建Hmmer模型，检索NCBI中高粱数据库获得E值小于0.05的序列，然后用SMART和NCBI-CD数据库验证其保守结构域。共鉴定到23个高粱KNOX基因；根据其在染色体上的位置分别命名为SbKNOX1～SbKNOX23；在高粱KNOX基因中，SbKNOX19所编码的氨基酸序列最长，为802 aa，而SbKNOX20所编码的氨基酸序列最短，为184 aa，说明该基因家族存在多样性，其余21个基因所编码的氨基酸长度介于231～770 aa之间；这23个基因所编码的氨基酸分子量大小介于20.23～86.14 kDa之间；SbKNOX11编码蛋白的理论等电点为7.28，表明该蛋白偏中性，而其余22个基因所编码蛋白的理论等电点介于6.56～4.76之间，均呈弱酸性；亚细胞定位预测可知，该家族基因全部位于细胞核中，且KNOX基因家族蛋白均属于亲水性蛋白(表1)。

表1 SbKNOXs基因编码蛋白的基本特征Table 1 Basic characteristics of the putative proteins encoded by SbKNOXs

2.2 高粱KNOX基因家族染色体定位分析

为进一步了解高粱KNOX家族基因在高粱染色体(n=10)上的分布规律，根据高粱数据库的信息，通过MG2C在线网站对23个高粱KNOX家族基因进行染色体定位分析。由图1可知，该基因家族共分布在8条染色体上，其中SbKNOX1、SbKNOX2、SbKNOX3、SbKNOX4、SbKNOX5、SbKNOX6、，SbKNOX7和SbKNOX8分布在chrom01染色体上；SbKNOX9、SbKNOX10、SbKNOX11、SbKNOX12和SbKNOX13分布在chrom02染色体上；SbKNOX14分布在chrom03染色体上；SbKNOX15、SbKNOX16、SbKNOX17和SbKNOX18分布在chrom04染色体上；SbKNOX19、SbKNOX20和SbKNOX21分别分布在chrom06、chrom07和chrom09染色体上；SbKNOX22和SbKNOX23分布在chrom10染色体上。

图1 高粱KNOX基因在染色体上的分布Fig.1 Distribution of KNOX genes in Sorghum bicolor chromosomes

2.3 高粱KNOX家族系统进化分析

为了解高粱KNOX基因家族的进化关系，利用MEGA 7.0软件将高粱KNOX家族蛋白序列与拟南芥、水稻的KNOX家族蛋白序列进行系统进化分析。拟南芥KNOX家族基因主要分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两大亚家族，其中At1g62360、At4g08150、At1g70510和At1g23380为Class Ⅰ类，At5g11060、At5g25220、At1g62990和At4g32040为Class Ⅱ类。参照拟南芥分类系统可知，高粱KNOX分为Class Ⅰ和Class Ⅱ类两大亚家族，其中Class Ⅰ类又可以分为Class ⅠA和Class Ⅰ B两类，Class Ⅱ类又可分为Class Ⅱ A、Class Ⅱ B和Class Ⅱ C三类。此外，高粱KNOX基因家族在Class Ⅰ类亚家族中有7个成员，Class Ⅱ类亚家族中有16个成员(图2)。

相比拟南芥KNOX基因家族而言，高粱KNOX基因家族存在数量不等和相似性不同的同源基因，这一现象表明KNOX基因在高粱和拟南芥中经历了不同的进化历程。但对于Class Ⅱ类家族成员来说, 除了SbKNOX5、SbKNOX15和SbKNOX22基因与拟南芥Class Ⅱ类基因有较近亲缘关系外, 大多数SbKNOXs成员形成了特有的进化支(图2)。

图2 KNOX基因家族进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of KNOX family

2.4 高粱KNOX基因家族结构分析

由高粱KNOX基因家族结构分析结果可知，高粱23个基因都具有非编码区和编码区，其中SbKNOX12和SbKNOX17均含有2个编码区；SbKNOX8、SbKNOX10、SbKNOX13和SbKNOX20含有3个蛋白编码区；SbKNOX6、SbKNOX7和SbKNOX16含有4个蛋白编码区；SbKNOX1、SbKNOX2、SbKNOX3、SbKNOX4、SbKNOX5、SbKNOX9、SbKNOX14、SbKNOX15和SbKNOX21含有5个蛋白编码区；SbKNOX6基因含有6个蛋白编码区；SbKNOX11基因含有8个蛋白编码区；SbKNOX19基因含有9个蛋白编码；SbKNOX18和SbKNOX23基因含有10个蛋白编码区(图3)。该家族基因结构中的内含子数目为1～9个。Class Ⅰ类中各亚类家族成员之间的内含子数目均为4个，外显子数目均为5个；Class Ⅱ类中各亚类家族成员之间，其外显子和内含子的数量存在较大的差异(图3)。

2.5 高粱KNOX蛋白保守功能基序分析

为进一步探究高粱KNOX家族功能，利用MEME网站预测了高粱KNOX家族的5个Motif。高粱KNOX家族基因含有4个主要的保守基序(图4-A)，其中Motif 1对应Homeobox KN结构域，Motif 2对应ELK结构域，Motif 3对应KNOX1结构域，Motif 4对应KNOX2结构域，Motif 5对应START结构域。由图4-B可知，Homeobox KN结构域是4个结构域中最为保守的，其中SbKNOX1、SbKNOX2、SbKNOX3、SbKNOX4、SbKNOX5、SbKNOX9、SbKNOX14、SbKNOX15、SbKNOX21和SbKNOX22都含有KNOX1、KNOX2、ELK和Homeobox KN结构域，而其余13个基因所编码的蛋白质只含4个保守结构域中的Motif 1(图4-A)，表明这13个基因可能不具有KNOX家族的完整功能或具有其他的功能。

2.6 SbKNOX22基因表达分析

为揭示高粱SbKNOX22基因在不同组织中的表达量，以及在水杨酸和环境胁迫处理下的表达模式，对高粱SbKNOX22基因在根、茎、叶、芽内的表达情况，以及其响应植物激素、干旱胁迫的表达情况进行了研究。结果表明，SbKNOX22基因主要在高粱叶片中表达(图5-A)。SbKNOX22经水杨酸处理6 h时表达量最高，随着时间的延长表达量显著下降(图5-B)，而在干旱胁迫下(PEG 6000和甘露醇处理)下，SbKNOX22表达量在0.5 h后降低(图5-C、D)，NaCl处理后，SbKNOX22在9 h时表达量最高(图5-E)。上述结果表明，SbKNOX22能够响应水杨酸、干旱和盐胁迫。

图3 高粱KNOX基因家族成员的结构分析Fig.3 Gene structure analysis of KNOX gene family in Sorghum bicolor

注：A：高粱KNOX家族隐马模型图案的位置；B：高粱KNOX家族隐马模型图。Note: A: Location of the hidden horse model pattern of sorghum KNOX family. B: Hidden horse model of sorghum KNOX family.图4 高粱KNOX家族保守基序分析Fig.4 Analysis of conserved motifs of KNOX family in Sorghum bicolor

注：内参基因：SbEIF4a；不同小写字母表示各处理之间差异显著(P<0.05)。Note: Internal reference gene: SbEIF4a. Different lowercase letters indicate the significance of variance analysis difference between each treatment at 0.05 level.图5 SbKNOX22基因表达分析Fig.5 SbKNOX22 gene expression analysis

3 讨论

高粱叶的形态建成影响高粱生长发育过程中的光合作用效率，从而影响高粱产量和品质。KNOX转录因子与植物叶片的形态建成有着密切联系[23]，因此鉴定和分析高粱KNOX基因家族对于改善高粱品质和提高其产量具有重要的作用。

KNOX基因作为一类特有的转录调控因子，在植物生长发育过程中起着至关重要的作用。研究发现，杨树(Populus)中KNOX基因参与分生组织的形成[24]；生长素和脱落酸能诱导大豆KNOX基因的表达，赤霉素则抑制其表达[7]；同样在豆科植物蒺藜苜蓿中KNOX基因参与其复叶的发育[25]。KNOX基因家族的各保守结构域发挥着不同的功能，KNOX 1结构域主要在KNOX基因异源表达后产生的表型变化阶段起重要作用[14]；KNOX 2结构域主要影响转基因植株表型异常变化和二聚体的形成[26]；ELK结构域能够参与蛋白之间的相互作用[27]。本研究高粱中共有10个KNOX基因包含以上3个保守结构域，推测这10个KNOX基因可能参与高粱的生长发育和形态建成。通过进化关系分析可知，高粱KNOX基因的分类与拟南芥一致，均分为Class Ⅰ类和Class Ⅱ类，但基因数量与拟南芥有较大差别，表明KNOX基因具有不同的进化历程，此外在Class Ⅱ类中出现了Class Ⅱ A和Class Ⅱ B两个分支成员均为高粱KNOX基因的现象，表明在高粱中KNOX基因可能进行了复制与扩增。高粱KNOX基因家族Class Ⅱ类各亚类家族成员的基因结构(包括外显子和内含子数目)发生了明显变化，这可能与高粱各KNOX基因的功能分化有关。

有研究发现，Class Ⅰ类基因在顶端分生组织中特异性表达[14]，参与侧生器官的形态建成，其表达与激素途径有着紧密的联系[28]。相对于Class Ⅰ类基因，Class Ⅱ类基因表达模式更丰富，能够在植物大多数器官中表达[14]，其表达具有普遍性，同时又具有特殊性[15]。本研究的组织特异性表达结果进一步证明了SbKNOX22为Class Ⅱ类基因，且与进化分析结果相符合(图2)。据报道，番茄中的KNOX家族基因Tkn4经过水杨酸处理后其表达量上升[29]，落叶松(Larixgmelinii)LgKNOX2基因经赤霉素处理后其表达量先上升后下降，而茉莉酸甲酯处理后该基因的表达量无明显变化[30]。系统进化树分析表明，本研究所选择的SbKNOX22基因与拟南芥KNAT3(At5g25220)和KNAT4(At5g11060)基因聚集在一起。已有研究表明，在拟南芥种子萌发和幼苗早期发育过程中，KNAT3能调节脱落酸的反应[31]。水杨酸在植物抗病过程中起着重要的作用[32]，高粱经水杨酸处理后，SbKNOX22表达量上升，表明该基因的表达受到水杨酸的调控，为后续研究该基因在水杨酸通路中的功能奠定了基础。据报道，PEG 6000能诱导部分高粱SBP-box和耐逆基因SbALDH7表达上调[33]。本研究发现PEG 6000处理后SbKNOX22基因的表达量先上升后下降，同时，NaCl胁迫处理后其表达量变化较大，推测SbKNOX22参与高粱对逆境胁迫的响应。

本研究对高粱KNOX基因家族进行鉴定，并对家族成员SbKNOX22在非生物胁迫条件下的表达量进行分析，但高粱KNOX基因家族所有成员在生物胁迫和非生物胁迫条件下的表达量情况，以及各个家族成员的功能等仍需进一步研究。

4 结论

本研究利用生物信息学分析方法，鉴定到23个高粱KNOX基因家族成员，系统发育分析显示高粱KNOX基因家族在进化中可能经历了较为复杂的过程。Motif分析发现有10个成员包含KNOX基因家族KNOX1、KNOX2、ELK和Homeobox KN 4个特有保守结构域，另外有13个高粱KNOX基因家族成员只含有Homeobox KN结构域。SbKNOX22基因主要在高粱叶片中表达，且其表达易受到水杨酸、干旱胁迫和盐胁迫的影响。本研究结果为进一步探究KNOX基因家族在高粱生长过程中的功能、信号转导等提供了基础。