IAC-UPLC 法测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法研究

□ 赵 芳 晋中市综合检验检测中心

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是小麦、玉米等谷物粮食中较为常见的真菌毒素之一，其污染范围也较广。人类与动物过量摄入DON 会引起呕吐、腹泻等急性中毒反应，故DON 也称为呕吐毒素；长期食用DON 污染的食品也会诱发食管癌、贫血、免疫能力下降等疾病，故科学准确地检测被其污染的粮食及其制品对保护人畜健康至关重 要[1]。GB 5009.111—2016[2]中 规定 了ID—LC/MS/MS、IAC—HPLC、TLC及ELISA 4 种检测方法，前者对于基层实验室而言，设备使用维护成本较高，后两者则仅适用于定性和半定量检测。因此，根据检测需求和设备条件建立和验证IAC—UPLC 法测定小麦粉中DON 的方法非常必要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦粉为市售。脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准物质（坛墨质检，编号72663，批号0871904）。乙腈、甲醇为色谱纯；聚乙二醇（分析纯）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）：称取8.0 g 氯化钠、1.2 g磷酸氢二钠、0.2 g 磷酸二氢钾、0.2 g氯化钾溶解于900 mL 水中，用盐酸调节pH 至7.0，用水稀释至1 L；实验用水为一级水。

1.2 仪器与设备

Waters UPLC 超高效液相色谱仪（配PDA 检测器）；电子天平（精度0.000 01 g）；超声波清洗机；离心机；氮吹仪；固相萃取仪；脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱等。

1.3 实验方法

1.3.1 试样前处理

①准确称取25 g 粉碎、过筛的试样于具塞三角瓶中，加入5 g 聚乙二醇，加入100 mL 纯水，摇匀，超声20 min，经玻璃纤维滤纸过滤后10 000 r/min下离心5 min，滤液待净化。②将冷藏的DON 免疫亲和柱恢复至室温，待其中原有液体流尽后，准确吸取2.0 mL试样滤液至免疫亲和柱中，控制样液以1 滴/秒的流速过柱，然后依次用5 mL PBS 和5 mL 纯水以1 滴/秒的流速淋洗小柱，弃去淋洗液并抽干小柱。③准确吸取2.0 mL甲醇至上述小柱中，控制1 滴/秒的流速洗脱亲和柱，收集洗脱液，于50 ℃下氮吹至近干，加入1.0 mL 甲 醇+ 水（20+80，V/V）涡旋溶解残留物，过0.2 μm 滤膜后待测。

1.3.2 标准系列配制

称取0.84 mg DON 标准物质，用乙腈溶解并定容至10.0 mL，配制得84 μg/mL 的标准储备液。再用甲醇+水（20+80，V/V）逐级稀释配制成84、168、420、840、1 680 ng/mL 与4 200 ng/mL 的标准系列。

1.3.3 液相色谱条件

液 相 色 谱 柱：C18柱（1.7 μm，100 mm×2.1 mm），柱温35 ℃；流动相：甲醇+ 水（20+80，V/V），等度洗脱，流速0.4 mL/min；检测器：PDA 检测器，波长218 nm；进样体积：10 μL；定性方法：保留时间；定量方法：峰面积外标法。

2 结果与分析

2.1 线性关系及检出限

将配制的DON 标准系列按照上述色谱条件测定，以标曲系列点浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=18x—642，相关系数为0.999 8，表明线性关系良好。以3 倍信噪比对应的目标物最低响应浓度为仪器最低检出限，根据试样处理过程中称样量25 g，稀释倍数50 倍，定容体积1 mL，计算得本方法检出限为51 μg/kg，低于国标方法中的检出限。

2.2 加标回收率与精密度

准确称取12 份不含DON 的阴性小麦粉试样，分为两组加入不同浓度水平的标准溶液，其中1 ～6 号试样中加入107 μg/mL 的DON 标准溶液100 μL，7～12号试样中加入107 μg/mL的DON 标准溶液370 μL，按照上述前处理过程操作、色谱条件测定，考察其加标回收率与精密度，计算得该方法的加标回收率为81.4%～100.9%，RSD为0.05%～0.07%，满足GB/T 27404—2008 的要求。

2.3 实际样品的测定

采用该方法测得某小麦粉中DON含量为613 μg/kg，为验证本方法的有效性，在期间精密度条件下由另一位检验员再次测定，测得其中DON 含量为590 μg/kg，两次测定绝对差值/算术平均值为3.8%，符合GB 5009.111—2016 的规定。

3 结论

本方法参照国标方法建立的IAC—UPLC 法测定小麦粉中DON 的检测方法，色谱分离效果较好，线性关系良好，检出限低于国家标准方法，加标回收率与精密度均符合相关规定，可以满足小麦粉及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测需求。