地龙促进创伤修复的研究进展

田林华 董坤 张天帅 王伟明（通讯作者）

（黑龙江省中医药科学院 黑龙江 哈尔滨 150036）

地龙（俗称“蚯蚓”），为钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的干燥体[1]。据《本草纲目》记载，地龙具有止痉、通络、清热、活血等功效，外用可治疗瘰疬、溃疡、口舌糜烂等。民间验方用地龙白糖浸出液治疗烧伤、烫伤，治愈率高且很少留有疤痕[2]，临床上常用地龙治疗创伤、下肢溃烂等疾病[3]。现代研究表明，地龙活性提取物能有效缩短创面愈合时间，降低瘢痕发生率，且无明显毒副作用，具有较高的开发价值。本文将近年来在地龙促进创伤修复的有效成分种类、分离纯化和作用机制等方面研究进行综述，以期为地龙的深入研究和开发利用提供参考。

1.地龙促进创伤修复有效成分的分离纯化

地龙自身的修复损伤和再生能力很强，由此推测其体内存在能够促进修复的物质。随着现代生物技术发展，目前从地龙中提取出促进创伤修复的有效成分主要包括抗菌肽、纤溶酶、抗氧化活性物质、镇痛相关物质及促创伤愈合物质等。

1.1 抗菌肽

抗菌肽，是各种动物、植物、微生物等的生物免疫系统在抵御病原微生物侵袭过程中产生的一类具有抗菌活性的多肽[4]。地龙中提取的抗菌肽，是其促进创伤修复的主要有效成分之一，具有热稳定性强、抗菌谱广、抗菌效果强、毒副作用小等优点。

张希春等[5]经盐析、超滤截留小于1ku 的组分、阳离子交换色谱及反相快速蛋白质液相色谱，从地龙组织匀浆中获得两种对革兰阳性菌、阴性菌和真菌均有不同抑制作用的小分子抗菌肽。崔东波等[6]采用葡聚糖凝胶柱层析对地龙蛋白粗提液进行分离纯化，获得一种对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等10 种菌都有一定的抑制作用的抗菌肽，经分析该活性肽的相对分子质量为5.5KD。Li 等[7]采用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱从地龙皮肤分泌物中分离纯化出一种新的抗菌肽—蚯蚓素-PG，研究表明该抗菌肽具有潜在的抗细菌和抗真菌活性。

1.2 纤溶酶

蚯蚓纤溶酶，是从地龙中提取的具有纤溶活性的组分。目前，国内外已有报道的蚯蚓纤溶酶多为含糖量在3%～15%的糖蛋白，其相对分子质量多在20 ～40KD 之间，有较高的热稳定性和酸碱稳定性，具有降低血小板聚集、降低血液粘度、改善创面微循环的作用。

Xing 等[8]通过凝胶过滤色谱、阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱获得一组相对分子质量分别为29KD 和24.849KD 的蚯蚓纤溶酶（eFE-D），该组分不仅能直接水解纤维蛋白，还能激活纤溶酶原使之转化为纤溶酶。武金霞等[9]采用亲和色谱、阴离子交换色谱，从地龙匀浆液中得到一组具有纤溶酶原激活活性的糖蛋白组分，两组兼有能直接水解纤维蛋白和激活纤维酶原活性的糖蛋白组分。周海等[10]经盐析、膜过滤及柱层析等方法得到一组相对分子量分别为32KD 和33.5KD 的蚯蚓纤溶酶组分，该组分能显著提高机体纤溶功能，具有良好的热稳定性和酸碱稳定性。

1.3 抗氧化活性物质

氧化应激反应是机体遭受有害刺激时产生的自由基过多，超出抗氧化系统的清除能力，从而导致细胞或组织损伤的一种病理反应[11]。氧化应激反应从创伤开始即发生，并伴随创伤修复整个过程，是影响创伤修复的重要因素之一[12]。地龙提取液中含有丰富的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽超氧化物酶(GSH-PX)等抗氧化酶[13]，能促进过氧化氢代谢，减轻氧化应激反应，对抗炎症损伤，促进创伤修复。

刘堰等[14]采用硫酸铵分级沉淀赤子爱胜蚓匀浆液，透析除盐后依次通过EDAE-纤维素层析柱及Sephadex G-75 层析柱，获得纯的铜锌超氧化物歧化酶，邻苯三酚自氧化法测定该酶总活力为11150U，比活为5138U/mg 蛋白，回收率为20%。廖怡等[15]采用闪式提取技术结合离子交换层析联合提取地龙中的SOD 和CAT，并通过柱层析等方法进行纯化，结果表明，纯化后的地龙SOD 比活达到9352U/mg，高于市售牛红细胞SOD 标准品，纯化后的地龙CAT 比活达到22606U/mg，高于市售黑曲霉CAT 和牛肝CAT。

1.4 镇痛相关物质

临床应用表明地龙对于烧烫伤和创伤具有良好的镇痛效果，但目前对其镇痛活性成分的相关研究报道较少，极大的限制了地龙的推广应用。

程果等[16]利用PB 液抽提、盐析及CM Sephadex C-50 阳离子交换层析等方法从地龙中分离得到2 个具有镇痛活性的蛋白组分，该组分能显著提高小鼠痛阈值，减少疼痛反应，镇痛效果持久。李锐等[17]通过3KD ～50KD 超滤管截留的地龙蛋白组分具有明显的外周镇痛作用，经凝胶过滤层析、阳离子交换层析及高效液相色谱纯化获得两个具有明显镇痛活性的组分，经测定其分子量分别为21.6KD 和28.2KD。

1.5 促创伤愈合物质

Hrzenjak 等[18]发现从地龙组织匀浆中获得的糖蛋白提取物（G-90）具有促进伤口愈合的作用。崔泓等[19]将地龙粗提液经盐析、DEAE 纤维素-DE52 离子交换层析及Sephadex G100 凝胶过滤层析，获得一组相对分子质量分别在87KD、72KD、57KD的蛋白组分，该组分与小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）增殖存在量效关系。段晓杰等[20]以断体地龙为研究对象，采用硫酸铵分段沉淀的方法获得S1、S2、S3、S4 四个蛋白组分，活性筛选结果显示S3 组分对NIH3T3 的增殖作用最强，活性蛋白浓度范围更广泛。

2.地龙促进创伤修复的作用机制

创伤修复是由多种类型细胞、细胞外基质成分及相关因子参与的复杂生物学过程，涉及止血和炎症反应阶段、细胞增殖和分化阶段、组织重塑阶段，三个阶段相互交叉覆盖[21]。研究表明，地龙活性提取物在创伤全过程都发挥着促进修复的作用。

2.1 止血及炎症反应阶段

2.1.1 降低血小板聚集，改善创面微循环

地龙活性提取物中含有胶原酶、纤溶酶等多种具有抗凝、促纤溶作用的蛋白酶，可改善血流变指数，通过降低血液黏度、降低血小板聚集、改善红细胞变形能力，发挥活血化瘀作用[22]。吕中明等[23]通过建立微循环障碍动物模型发现，地龙提取物治疗组能明显减少微血管中血细胞聚集团块、加快微血流速度，体外红细胞聚集试验表明，在中、低切变率时，地龙提取物能明显改善红细胞聚集状态和红细胞变形能力，提示地龙提取物是一种微血管循环改善剂。J i 等[24]研究发现，蚓激酶（L K）通过增强腺苷酸环化酶（A C）活性，上调环腺苷酸（cAMP）水平，抑制Ca2+内流，发挥抗血小板聚集活性。

2.1.2 抗炎及抗氧化

在炎症反应阶段，炎性细胞被激活并将产生大量的过氧化物，发挥杀菌、调节炎症及信号转导等作用[25]。当产生的过氧化物超出机体清除能力就会引起氧化应激反应，从而影响创伤的正常修复。地龙提取物既能有效干预炎症反应，又能提高由SOD、CAT、GSH-PX 组成的抗氧化体系能力，清除过多的氧化产物，提高机体抗氧化能力。黄敬文等[26]发现鲜地龙提取液作用较温和，对皮肤表皮破坏较小，还具有明显的镇痛、抗炎作用。Sun 等[27]发现，由地龙和水蛭组成的疏血通注射液能抑制活性氧和线粒体过氧化物生成，并通过抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等因子的表达，抑制过度的炎症反应。Grdisa 等[28]用H2O2处理人成纤维细胞和上皮细胞前，加入地龙糖蛋白提取物（G-90）孵育48h 细胞没有发生氧化损伤，用H2O2处理细胞4h 后，加入G-90 可以使细胞恢复并刺激细胞生长，结果表明，G-90 具有明显的对抗H2O2毒性和刺激细胞生长的作用。

2.2 细胞增殖、分化阶段

2.2.1 对细胞的影响

成纤维细胞是主要的组织修复细胞之一。组织受损后，创面边缘成纤维细胞被激活、增生并分化成肌成纤维细胞，参与创面收缩，增加胶原和细胞外基质成分的合成与分泌。此外，在细胞增殖、分化阶段，巨噬细胞等炎性细胞和表皮细胞等修复细胞能协同成纤维细胞促进创伤修复[29]。地龙提取物能活化巨噬细胞，增强吞噬活性，提高一氧化氮（NO）和TNF-α 的分泌水平，并对环磷酰胺等药物引起的免疫抑制具有明显拮抗作用[30]。张凤春等[31]通过建立大白兔背部创伤模型发现，地龙通过促进肌纤维母细胞增生，分泌较多的肌动蛋白，促进伤口收缩，从而促进创伤愈合。Song 等[32]研究表明，地龙活性蛋白可能通过PI3K →Rac →PAK →MEK 信号途径，促进小鼠胚胎成纤维细胞增殖和迁移。

2.2.2 对生长因子的影响

生长因子在创伤修复过程中起重要作用，它们与靶细胞上的特异受体结合，参与调控创伤修复多种细胞反应，影响细胞增殖、迁移、细胞外基质合成和释放等[33]。Grdisa 等[34]发现，G-90 治疗创面中表皮细胞生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）浓度远高于健康皮肤和生理愈合创面，表明G-90 能有效缩短创面愈合时间，促进创伤修复。Lee 等[35]发现蚓激酶通过增加转化生长因子-β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（PDGF）及神经生长因子（NGF）的分泌，实现促进周围神经损伤再生修复的作用。于兴兵等[36]证实地龙提取液能显著提高患者血清中血管内皮生长因子（VEGF）水平，从而促进内皮细胞增生和新毛细血管形成，为成纤维细胞的增殖及胶原的合成提供足够的营养物质。

2.2.3 促进肉芽组织形成

在创伤中早期，细胞因子表达水平升高会促进创面新生血管的形成，促进皮肤再上皮化，促进胶原合成与分泌，使肉芽组织加速生长填充创面，从而促进创面愈合。Deng 等[37]推测地龙提取物（EE）促进创伤愈合的机制可能是通过加速羟脯氨酸（HYP）和TGF-β 的分泌，促进毛细血管形成，促进成纤维细胞增殖，增加胶原蛋白的合成与分泌，从而促进肉芽组织和表皮覆盖。李东冰等[38]报道鲜地龙制成的溶液（创愈新）能明显缩短痔疮术后创面的愈合时间，加快创面表皮生长速度。章梅等[39]通过建立大鼠深Ⅱ度烧伤模型，研究地龙提取物对创面愈合作用的影响，结果表明地龙提取物能明显减轻创面加深程度，降低创面水肿程度，促进肉芽组织形成，缩短大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合时间。

2.3 组织重塑阶段

2.3.1 对成纤维细胞及生长因子的影响

创伤修复过程中成纤维细胞经历了增殖型、迁徙型、分泌型、肌成纤维细胞型，一旦上皮化完成，这些过程结束，成纤维细胞进入凋亡途径而逐渐消失[40]。若成纤维细胞异常增殖，会使细胞外基质大量沉积、多种生长因子异常表达，导致创伤修复异常[41]。陈洪等[42]研究发现，地龙2 号能降低TGF-β1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平，降低细胞外基质合成，减轻大鼠肝纤维化程度。黄敬文等[43]实验表明，地龙蛋白通过下调细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表达抑制人增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）增殖，通过上调半胱天冬酶-3（Caspase-3）的表达，下调T G F-β1、B 淋巴细胞瘤-2 基因（B c l-2）的表达诱导H S F细胞凋亡。

2.3.2 减少病理性瘢痕的形成

瘢痕是创伤修复的必然结果，但炎症反应过度、胶原合成与降解失衡等均会导致创伤修复异常，从而形成病理性瘢痕。吴俊荣等[44]采用鲜地龙匀浆液外敷不仅能明显促进创伤愈合，还能减少创面炎性反应，减少成纤维细胞数量和胶原合成，从而减轻兔耳增生性瘢痕纤维化程度。黄敬文等[45]对兔耳增生性瘢痕组织中Ⅰ胶原、Ⅲ胶原和基质金属蛋白酶-1(MMP-1) mRNA的表达水平进行检测，结果表明，地龙通过抑制Ⅰ胶原的表达，促进Ⅲ胶原及MMP-1 的表达，实现抑制胶原合成、促进胶原降解、减少增生性瘢痕形成的作用。

3.结论

地龙提取物促进创伤修复作用缓和、疗效确切、无明显毒副作用，是外用中药治疗创伤的新热点。目前，关于地龙促进创伤修复的研究尚存在一些问题：一是国内外关于地龙促进创伤修复有效成分的分离纯化及结构鉴定多集中于纤溶酶、抗菌肽和抗氧化活性物质，对镇痛相关物质和促创伤愈合物质的报道较少；二是虽然临床实践表明，地龙对于烧伤、烫伤等难愈性创伤的治疗作用显著，但由于创伤修复是一个极为复杂的动态过程，关于地龙促进创伤修复作用机制的研究还处于初级阶段，具有较大的探索空间；三是关于创伤修复的研究一般包括动物模型、临床观察、细胞培养等方式，但由于动物与人在皮肤结构上有较大的差异，创伤修复机制也有所不同，选择理想的动物模型极为困难，因此加强动物实验模型的研究，有助于从不同水平上深入认识地龙促进创伤修复的机理。