莪术油超声提取工艺优化及生物活性研究*

2020-12-03赵海燕班颖芳张义浩蔡吉祥

广州化工 2020年22期

赵海燕，许钰，班颖芳，张义浩，蔡吉祥

(1 广西科技师范学院食品与生化工程学院，广西来宾 546119；2 广西科技师范学院特色瑶药资源研究与开发重点实验室，广西来宾 546119)

广西莪术也称桂莪术，为广西莪术(CurcumakwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang)的干燥根茎，是广西的道地药材，其有行气破血、消积止痛的功效[1-2]。近年来研究发现莪术油具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、消炎等多种生物活性[3]。现阶段挥发油提取方法有水蒸气蒸馏法、超临界流体萃取法、索氏提取法等[4-6]。超声辅助提取法是通过机械振动产生能量在介质中传播而使物质分子发生碰撞产生新物质的过程，该方法是一项易掌握，较为安全、提取温度低、时间快、提取率相对高的新技术，已广泛应用于中草药油脂的提取[7-9]。本实验利用超声辅助提取法，通过单因素和正交实验优化了广西莪术挥发油提取工艺，并分析了挥发油的抗氧化和抗菌活性，以期为莪术油进一步开发利用提供基础理论参考。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

广西莪术购自亳州市众益堂中药材销售有限公司，经广西科技师范学院特色瑶药资源研究与开发重点实验室张鹏博士鉴定为广西莪术。DPPH购自上海思诚化工科技有限公司；铁氰化钾、乙醇、双氧水等试剂均为分析纯，购自武汉长城化成科技发展有限公司；枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌来自广西科技师范学院实验楼微生物实验室。

1.2 实验仪器

RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D(III)型循环水多用真空泵，巩义市科瑞仪器有限公司；BILON-S6多频恒温超声波提取机，上海比朗仪器制造有限公司；UV-9600型紫外/可见分光光度计，北京北分瑞利分析仪器公司；SPX-250B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1F型洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。

2 实验方法

2.1 超声辅助提取工艺优化方法

2.1.1 超声辅助提取挥发油方法

将烘干的莪术粉碎后过60目筛，准确称取过筛的莪术粉末20.0 g于500 mL烧杯中，加入一定量的无水乙醇，混匀后放入多频恒温超声波提取器中，以一定的功率提取一定时间后，抽滤数次至滤纸无残渣，滤液倒入已称重的圆底烧瓶内，在旋转蒸发仪上挥干溶剂，于恒温干燥箱中干燥后冷却至室温称重，按以下公式计算提取率：

(1)

式中m1为莪术粉质量；m2为空瓶质量；m3为莪术油加瓶总质量。

2.1.2 单因素实验

利用超声辅助提取法，分析无水乙醇与莪术粉的比例(A)、超声功率(B)和提取时间(C)三个因素对挥发油提取率的影响。单因素梯度设为：无水乙醇与莪术粉的比例依次为9:1、12:1、15:1、18:1、21:1 mL/g；提取时间分别设为5、10、15、20、25 min；超声功率设定为600、700、800、900、1000、1100、1200 W。每个单因素用料量为20 g。选定一组单因素条件实验后，其他因素条件逐一进行实验。

2.1.3 正交实验

根据单因素实验结果每个因素选择3个水平进行正交实验。正交实验后通过极差分析得出超声辅助提取广西莪术挥发油的最佳提取条件。

2.2 体外抗氧化活性测定方法

2.2.1 还原能力测定

由于还原能力的强弱可以反映药物潜在的抗氧化性能，因此首先对分离的挥发油进行了还原能力测定。分别取2.0 mL样品溶液或对照品(Vc)溶液(6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL)依次加入等体积的pH 6.6磷酸盐缓冲液和1%铁氰化钾溶液，混匀后在50 ℃水浴中保温大约20 min。再加入2.0 mL的10%的三氯乙酸溶液。取3.0 mL上述混合液，加入等体积去离子水和0.6 mL的0.1% FeCl3溶液，静置10 min以后。在700 nm下测定各样品的吸光值。测得的吸光值越大说明样品的还原能力越强[10]。

2.2.2 清除DPPH自由基能力测定

在10.0 mL 60 μmol/L的DPPH·乙醇溶液中加入2.0 mL 样品或对照品(Vc)溶液，25 ℃放置30 min后在517 nm测得吸光值[9]。自由基清除百分率SE(%)按下式计算。

(2)

式中A0是溶剂为空白的吸光值；AX为加入了样品或对照品溶液的吸光值；AY为乙醇代替显色剂时样品或对照品的吸光值。

2.2.3 清除羟基自由基(·OH)能力测定

本实验采用Fenton法[10-11]测定超声辅助提取的莪术挥发油对羟基自由基的清除能力。样品和对照品Vc的浓度依次设定为6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL。对·OH的清除率SE(%)按(2)式计算。其中A0为以溶剂代替样品或对照品的试剂空白吸光值。

2.3 抗菌活性测定方法

本实验采用滤纸片扩散法[13]对超声辅助提取的莪术油的抗菌活性进行研究。先取200 μL浓度为105～106cfu/mL的菌悬液于干净无菌空皿上，将熔化冷却至45 ℃左右的培养基快速倒入并水平转动与菌悬液混匀。待混合皿凝固后，用灭菌过的镊子取出浸有样液的滤纸片，选好距离放在混合皿上，每组设阳性对照样片，阴性对照样片。贴好滤纸片后倒置放入培养箱，37 ℃恒温培养12～18 h后，测量各抑菌圈的大小。按照抑菌圈直径d>15 mm为抑菌敏感，15 mm>d>7 mm为有抑菌效果，d<7 mm为无抑菌效果，分别记录各样品组和阳性对照组的实验结果。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验结果

3.1.1 液料比对挥发油提取率的影响

从图1中可以看出在提取时间15 min、超声功率1000 W时，不同液料比对挥发油提取率的影响。液料比小于15:1 mL/g时，液料比增大提取率不断升高；当液料比大于15:1 mL/g时，提取率开始下降。结果表明最佳液料比为15:1 mL/g时，挥发油的提取率为4.21%。

图1 液料比对挥发油提取率的影响

3.1.2 提取时间对挥发油提取率的影响

根据上述单因素实验结果，选择在液料比15:1 mL/g和超声功率为1000 W时，测定超声时间对提取率的影响，实验结果(见图2)表明随着超声波提取时间的延长提取率逐渐增大但是超过15 min后提取率的增加并不显著。从整体工艺的效率考虑确定了最佳提取时间为15 min，此时提取率为4.28%。

图2 超声提取时间对挥发油提取率的影响

3.1.3 超声波功率对挥发油提取率的影响

从图3可以看出，在液料比为15:1 mL/g和超声提取时间为15 min时，莪术油的提取率随着超声波提取功率的增加先增大后减小。在超声功率小于1000 W时，超声功率越大超声机械振动频率越大，物质分子降解能力越强，莪术油的提取率也越高，但是当超声功率超过1000 W后，提取率基本不再增加甚至有下降的趋势，可能是因为超声功率过大时挥发油收集效率受到一定影响。当超声波提取功率为1000 W时提取率为4.30%。