拐枣与拐枣养生酒总黄酮的含量分析比较研究*

杨 玥，杨再波，贺银菊，苏 军，刘娇娇，邓 焦，郭银粉，梁馨亓

(1 黔南民族师范学院化学化工学院，贵州 都匀 558000；2 福泉市中医医院，贵州 福泉 550500)

拐枣(Hovenia acerba Lindl.)又名：万寿果、金钩梨、鸡爪子、龙爪、蜜爪爪等等，属鼠李科(Rhamnactae)落叶乔木，在我国分布广泛，主要分布在甘肃、陕西、河南、安徽、广东、广西、湖南、湖北、四川、云南、贵州等省区，由于果序轴肥厚、肉质多汁，营养丰富，可生食、酿酒、制醋、熬糖、加工果汁饮料等，民间常用以浸制“拐枣酒”。具有解酒、通利二便、祛风通络止痉、止渴除烦、降血压等作用[1-4]。

黄酮类化合物是一类存在于自然界的重要天然有机化合物，是植物的重要次生代谢产物，也是一类重要的中药有效成分和一种新发现的营养素[5]。具有抗炎症、抗过敏、抑制病毒、防治肝病、防治血管疾病、防治血管栓塞、防治心与脑血管疾病、抗肿瘤、消除疲劳、抗脂肪氧化、抗衰老、降血脂、降血压等多种功效[6-10]。因此，我们对拐枣与拐枣制成的养生酒中的总黄酮含量进行分析比较，旨在为拐枣养生保健产品的开发提供科学参考。

1 实 验

1.1 实验材料

1.1.1 试剂与原料

乙醇，芦丁(纯度为99%)，5%亚硝酸钠溶液，10%硝酸铝溶液，5%氢氧化钠溶液等。野生拐枣(产地都匀市)，56°食用白酒(原料大米，产地都匀市)。

1.1.2 仪 器

JK-LIC-480DE超声波清洗机；TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HHS型电热恒温水浴锅；FW-80高速万能粉碎机；AUY-220分析天平；9070MBE电热恒温鼓风干燥箱等。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的制作

(1)标准溶液的准备：精密称取芦丁对照品 20.0 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入95%乙醇溶液并稀释至刻度，摇匀即得含芦丁0.20 mg/mL标准溶液贮备液[6]。

(2)标准曲线的制备：精密吸取标准溶液 0.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、12.00 mL分置于50 mL容量瓶中，各加95%乙醇12 mL，加5%亚硝酸钠溶液2 mL，混匀，放置 6 min，再加10%硝酸铝溶液2 mL，混匀，放置6 min，加5%氢氧化钠试液20 mL，最后用95%乙醇稀释至刻度，摇匀，以第一瓶为空白溶液，用TU-1901双光束紫外可见分光光度计，在510 nm上测定吸光度。以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，结果可见表1。

1.2.2 拐枣中总黄酮含量的测定[11-19]

(1)将市售新鲜拐枣烘干，搅碎，然后分别称取2 g，置于三个100 mL锥形瓶中，每个锥形瓶2.0000 g，分别加入70%的乙醇溶液50 mL进行超声波提取，温度70 ℃，提取30 min，冷却后分别过滤，然后分别将滤液转移到100 mL容量瓶中，最后用70%的乙醇溶液定容，作为总黄酮待测液。

(2)分别精密吸取上述三个总黄酮待测液2.00 mL，分别移至50 mL容量瓶中，然后分别加95%乙醇12 mL，分别加5%亚硝酸钠溶液2 mL，混匀，放置6 min，再分别加10%硝酸铝溶液2 mL，混匀，放置6 min，分别加5%氢氧化钠试液20 mL，最后分别用95%乙醇稀释至刻度，摇匀，在510 nm上测定吸光度A，平行三次。按照回归方程计算样品总黄酮含量，结果可见表5。

1.2.3 拐枣养生酒总黄酮含量的测定[11-20]

(1)称取100 g拐枣，将其放入酒坛中，然后加入56度的食用白酒1000 g，然后密封保存，每天振摇2～3次，21天后，将其过滤，用56度的食用白酒将其定容到1000 mL，即得拐枣养生酒，将此拐枣酒作为总黄酮的待测液。

(2)精密吸取拐枣酒总黄酮待测液3.00 mL，并移于50 mL 容量瓶中，然后加95%乙醇12 mL，加5%亚硝酸钠溶液2 mL，混匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液2 mL，混匀，放置6 min，加5%氢氧化钠试液20 mL，最后用95%乙醇稀释至刻度，摇匀，在510 nm上测定吸光度A，平行三次，按照上述标准曲线回归方程计算拐枣养生酒总黄酮含量。结果见表6。

1.2.4 总黄酮含量计算公式

C——根据芦丁标准曲线算出的黄酮浓度，mg/mL

N——稀释倍数

V——最初提取液的体积，mL

m——提取用拐枣的质量，g

2 结果与讨论

2.1 标准曲线回归方程

由上述方法1.2.1可得，实验结果见表1，由表1可知，得回归方程A=0.00782C+0.04415，线性相关系数为R2=0.9998，芦丁标准品浓度为8.0～48.0 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

表1 标准曲线制作

2.2 分析方法的验证

2.2.1 重复性实验

以拐枣样品制备来研究分析方法的重复性，同时精密称量2.0000 g拐枣样品6份，按照上述1.2.2方法进行样品制备和分析总黄酮含量，分析结果如表2所示。根据回归方程计算出总黄酮含量，6次平行实验得到的重复性，由表2可知，相对标准偏差RSD=2.11%。

表2 拐枣中总黄酮含量方法重复性实验结果(n=6)

2.2.2 回收率实验

以拐枣样品制备来研究分析方法的回收率，取已测定含量的样品，添加一定的标准品芦丁，测定回收率。结果见表3。由表3可计算出，其平均回收率为91.67%，相对标准偏差RSD=2.55%(n=6)。

表3 拐枣样品分析方法回收率实验结果(n=6)

2.2.3 稳定性试验

选标准溶液中的1号、3号，5号与其中一个样品管来测定其吸光度后，然后分别放置10、20、30、60和90 min后，再分别测定其吸光度，结果见表4。由表4可以发现，标准溶液及样品在放置30、60和90 min后，其吸光度的值相对比较稳定。

表4 拐枣总黄酮分析方法稳定性实验结果

2.2.4 方法的检出限

对其进行了20次全试剂空白吸光度平均值为0.002，按3倍空白值的标准偏差计算该方法的检出限为0.2 μg/mL。

2.3 总黄酮含量分析

2.3.1 拐枣中总黄酮含量分析

根据上述方法1.2.2对拐枣中总黄酮含量测定，结果分析见表5。由表5可知，拐枣的总黄酮平均含量为12.93 mg/g，总黄酮平均提取率为1.30%。

表5 拐枣中总黄酮含量

2.3.2 拐枣养生酒中总黄酮含量分析

根据上述方法1.2.3对拐枣养生酒中总黄酮含量测定，结果分析见表6。由表6可知，拐枣养生酒中的总黄酮平均含量为1.48 mg/g，总黄酮平均浸出率为0.15%。从结果分析中，可以看出拐枣养生酒中总黄酮含量比拐枣中总黄酮含量低，可能原因是浸泡拐枣的时候由于白酒溶液进入拐枣的细胞壁中浸出黄酮类物质，在细胞壁内外之间浓度差为自然浸泡推动力，当细胞壁内外达到一定的浓度后形成了浓度平衡，所以拐枣浸泡出总黄酮含量比拐枣要低。因此，要提高拐枣养生酒中的总黄酮含量就必须破坏这一浓度平衡，即可提高浸出浓度。

表6 拐枣养生酒的总黄酮含量

3 结 论

通过实验研究表明，在波长510 nm下，芦丁标准品浓度在8.0～48.0 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，线性相关系数R2为0.9998。同时对其进行了分析方法的验证，建立的方法重复性相对偏差为2.11%；平均回收率为91.67%，相对标准偏差RSD=2.55%(n=6)；并进行了稳定性实验分析，结果表明在60 min内比较稳定；建立的分析方法的检出限为0.20 μg/mL。说明我们建立的实验分析方法步骤简单，稳定性好，精密度高，在90 min 以内不受放置时间的影响。采用建立的分析方法对样品进行分析，拐枣中的总黄酮含量为12.93 mg/g，提取率为1.29%；而拐枣养生酒中的总黄酮含量为1.48 mg/g，浸出率为0.15%。由此可知拐枣中含有丰富的黄酮类化合物，研究结果，能够为拐枣作为保健养生品来开发提供科学依据。