慢性阻塞性肺疾病急性加重风险高危与低危患者呼吸道微生态系统差异分析

盛美玲 汪群智

最新流行状况调查显示我国40岁以上人群COPD患病率已高达13.7%[1]。COPD患者非常容易出现反复的急性加重(AECOPD)，急性加重频繁的患者有更快速的肺功能下降、更多的需要住院治疗，并有抑郁、焦虑的发病率增加以及更差的生活质量，严重影响患者的健康状况[2]。因此，减少COPD急性加重的发生，是COPD治疗的最重要目标之一。近年来微生物高通量测序技术发展迅速，一些研究发现与COPD相关的呼吸道微生态系统变化是急性加重发生发展的一个重要组成部分[3]。故而，了解呼吸道微生态系统与COPD急性加重风险的关系，指导靶向干预以减少COPD急性加重和病情进展，有着重要的意义。

资料与方法

一、研究对象

选取我院呼吸内科2017年3月至2018年6月间就诊的稳定期COPD患者60例作为研究对象，所有患者签署知情同意书。依据COPD指南《GOLD：Global Strategy for Diagnosis, Management, and Prevention of COPD，updated 2019》标准[4]，选择在本院门诊就诊或出院后随访的稳定期COPD患者，依据慢阻肺综合评估方法，选择急性加重风险高危组(A组)患者30例：患者上一年度发生过2次及以上的急性加重史或上一年度因急性加重住院1次，肺功能分级Ⅲ～Ⅳ级(肺功能提示FEV1占预计值%<50%)；低危组(B组)患者30例：患者上一年度发生过少于2次的急性加重史，且上一年度未因急性加重住院，肺功能分级Ⅰ～Ⅱ级(肺功能提示FEV1占预计值%≥50%)。当肺功能风险评估与急性加重史评估结果不一致时，以评估得到的最高风险为准。

二、分组

入组标准：COPD诊断符合GOLD 2019版《Global Strategy for Diagnosis, Management, and Prevention of COPD，updated 2019》[4]诊断标准分级并入组：在吸入支扩剂后，第1秒用力呼气容积与用力肺活量的比值<70%并排除其它肺部疾病；患者均处于病情缓解稳定期，近3月内患者咳痰、呼吸困难或喘息症状稳定，近2月内未出现急性上呼吸道感染，近4周内没有使用抗菌药物或全身性激素；签署知情同意书。排除标准：有其他肺部疾病如哮喘、肺癌、支气管扩张症、肺部结核等；有严重心、肝、脑、肾、癌症、血液系统疾病、有自身免疫系统疾病者等。

三、方法

1 呼吸道标本样本收集

用1%的利多卡因液雾化进行呼吸道局部麻醉，静脉推注咪达唑仑2mg，患者取仰卧位，用纤维支气管镜行肺泡灌洗，将气管镜嵌入右肺中叶的一个亚段，顶端要紧密嵌顿亚段支气管开口，防止大气道分泌物混入和灌洗液外渗，共注入加热至37℃的灭菌生理盐水150mL，每次20～50mL，总回收率≥30%，回收后，初步质控，标本合格要求：(1) 灌洗液中没有大气道分泌物的混入；(2) 回收率>40%，活细胞占95%以上；(3) 红细胞<10%，上皮细胞<5%；(4) 细胞形态完整、无变形，分布均匀。然后送到实验室分装后高速离心，后放置—80℃保存。同时留取5～10mL灌洗液送细菌室做细菌培养。

2 DNA抽提和PCR扩增

根据E.Z.N.A○Rsoil试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S)说明书进行总DNA抽提，DNA纯度利用NanoDrop2000检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物对V3-V4可变区进行PCR扩增。扩增体系为 20ul，4ul 5*FastPfu 缓冲液， 2ul 2.5mM dNTPs，0.8ul 引物， 0.4ul FastPfu 聚合酶；10ng DNA 模板。

3 高通量测序

使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物后纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖凝胶电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST (Promega, USA)进行检测定量。根据Illumina MiSeq 平台 (Illumina, SanDiego,USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建 PE2*300 的文库。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行高通量测序分析。

四、统计学方法

结 果

一、临床资料

两组患者一般资料 急性加重风险高危组患者(A组)30例，其中男性24例，女性6例，平均年龄(71.1±11.6)岁；急性加重风险低危组(B组)患者30例，其中男性23例，女性7例，平均年龄(70.7±10.5)岁；两组间性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

二、高通量测序结果

1 60例标本稀释曲线(图1)。

2 60例标本Alpha多样性分析(表1)：测序结果发现，两组间呼吸道菌落在多样性上无显著性差异(P>0.05)。

表1 两组患者呼吸道菌群Alpha多样性指数组间差异数据表

图1 60例BALF标本稀释曲线

当曲线走向逐步趋向于平坦时，说明测序数据量足够，由上图可以看出，所有标本曲线均趋向于平坦，提示测序量合理。

3 60例标本门水平群落Bar图(图2)及属水平Bar图(图3)：通过Bar图我们可以发现，COPD患者BALF中微生物群非常丰富，且不同的样本有着一定的差别，但主要以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门为主。但高危及低危组间微生物群在门、属等水平上丰度有无差别仍需进一步做组间物种差异分析。

图2 所有标本门水平群落Bar图

图3 所有标本属水平群落Bar图

图2、3注解：横坐标为相关物种在样本中的比例，纵坐标是样本编码，不同的物种以不同的颜色表示。

4 两组之间物种在门水平(图4)及属水平(图5)的丰度差异分析：我们发现，在门水平上，A组患者BALF中梭杆菌门丰度明显低于B组(t=-1.998，P=0.049)；在属水平上，A组患者BALF中假单胞菌属丰度明显高于B组(t=4.380，P=0.001)。其它门、属水平菌群丰度则无明显差异(P>0.05)。

图4 两组患者门水平物种丰度差异

图5 两组患者属水平物种丰度差异

讨 论

长期以来，下呼吸道微生物的实验室检查主要依赖于呼吸道分泌物的细菌培养，但环境中大部分的微生物使用常规的实验室培养方法并不能培养出，故而，人们长期错误的认为肺部是无菌环境。近年来以高通量测序技术对细菌16S rRNA进行测序为基础的宏基因组学检测方法的发展避免了分离培养的局限性，可全面深入的反映微生态系统结构和功能特点[5]，使呼吸道菌群多样性的研究得到了明显的进展。

近年来，基于16S rRNA的微生物结构分析方法已经发现呼吸道微生物群在结构以及多样性上非常丰富。Glendinning等[6]使用支气管镜对肺部取样进行16s RNA测序，发现肺部的微生物群落丰富多样。有学者研究发现健康人群和COPD患者的肺部存在的主要菌群相仿，均以链球菌属、普雷沃氏菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、梭杆菌属、不动杆菌属、葡萄球菌属、韦荣氏菌属为主，但是健康人群和COPD患者肺部中的微生物群在丰度上存在差异[7]。Pragman等[8]通过对中重度COPD患者的肺泡灌洗液测序发现，中重度COPD患者下呼吸道内变形菌门、厚壁菌门和放线菌门含量非常丰富。但是目前尚未有相关研究报道COPD急性加重高危及低危患者之间呼吸道微生态系统是否存在着差异。

我们通过对60例COPD患者的肺泡灌洗液行高通量测序发现，COPD患者BALF中微生物群非常丰富，以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门为主，与Cabrerarubio R[9]的研究高度一致，Ditz[10]通过对COPD患者的痰液菌群测序亦发现COPD患者呼吸道内4大常见的菌门为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门。我们通过Alpha多样性分析本研究发现两组间微生物群的多样性并无明显差异，但是在丰度水平上部分菌群出现了一定差异，在门水平上，急性加重高危组患者BALF中梭杆菌门丰度明显低于低危组；在属水平上，急性加重高危组患者BALF中假单胞菌属丰度明显高于低危组。但是，是否由于这种菌群丰度的变化从而引起COPD的反复急性加重，本研究尚不能给出答案，仍需做进一步研究。

近年来，已经有部分学者开始研究相关微生物功能，Ditz等[10]利用宏基因组学技术分析，发现与健康个体相比，COPD呼吸道细菌碳水化合物代谢基因明显减少，核苷和核苷酸基因发生水平转移，且气流受限严重程度(FEV1)和细菌唾液酸代谢能力正相关。而Millares L[11]发现，在COPD稳定期和急性加重的样本之间，没有发现到支气管微生物群的种属差异变化，基于MG-RAST宏基因组技术平台分析发现，在急性加重期患者中，细菌在碳水化合物代谢、细胞生长和死亡以及运输和分解代谢功能上出现了显著的变化，揭示这种功能层面的变化而非种群结构的变化可能与COPD反复急性加重有关。但是，目前功能基因的全宏基因组检测费用昂贵而限制了临床的使用。

综上所述，我们研究亦发现COPD患者的呼吸道微生物群非常丰富，以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门为主，COPD急性加重高危及低危患者呼吸道微生物群的多样性并无明显差异，但是急性加重高危组患者BALF中梭杆菌门丰度明显低于低危组，而假单胞菌属丰度明显高于低危组。但是，基于检测费用昂贵，我们目前完成的病例数仍较少，以后仍需进一步扩大样本量对目前的数据进行修正确认。