SARS-CoV-2 N蛋白和S蛋白抗体检测在COVID-19诊断中的应用

田亚玲， 鲁君艳

（永州市中心医院检验科，湖南 永州 425000）

目前，新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）确诊依据仍为荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）和病毒基因测序。但核酸检测结果阴性不能排除严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染，需要排除可能产生假阴性的因素。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》[1]首次将血清SARS-CoV-2特异性抗体作为COVID-19确诊的指标之一。徐万洲等[2]的研究结果显示，血清SARS-CoV-2免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M抗体和IgG抗体联合检测可以与SARSCoV-2核酸检测互补。血清SARS-CoV-2抗体检测不仅简单、快速，而且能区分急性感染和既往感染，更适合基层医院使用。SARS-CoV-2中至少有27种蛋白质，包括15种非结构蛋白（nsp1～nsp10，nsp12～nsp16）、4种结构蛋白（S、E、M和N）和8种辅助蛋白（3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b和orf14）[3]。严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）的2种结构蛋白具有良好的免疫原性，免疫原性最强的是核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白，N蛋白在包装成为成熟病毒之前就已经在细胞内大量表达，是感染过程中表达数量最多的病毒相关蛋白[4]；其次是刺突（spike，S）蛋白，由S1亚单位和S2亚单位组成，S1亚单位包含受体结合域（receptor binding domain，RBD），可与宿主细胞的血管紧张素转化酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受体结合[5]。S蛋白能诱导机体产生中和抗体，是诊断和疫苗研究的理想抗原[6]。目前，关于SARS-CoV-2哪种蛋白用于抗体检测来诊断SARS-CoV-2感染较好尚无相关报道。为此，本研究选择分别以SARS-CoV-2 N蛋白和S蛋白的RBD片段为包被抗原的4种酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，并比较其诊断性能。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2020年1月21日—2月8日永州市中心医院确诊的COVID-19患者（COVID-19组）39例，其中男24例、女15例，年龄5～56岁。SARS-CoV-2核酸检测均为阳性。COVID-19患者样本采集时的患病时间为（20±5）d。选取同期永州市中心医院收治的咳嗽、发热或肺炎患者40例（疾病对照组），其中男25例、女15例，年龄14～58岁。收集2019年8—10月永州市中心医院保存的体检健康者样本225份（正常对照组），其中男性样本134份、女性样本91份，体检健康者年龄18～62岁。正常对照组和疾病对照组均经核酸检测排除SARS-CoV-2感染。3个组年龄、性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂

SARS-CoV-2 N蛋白IgM抗体ELISA试剂盒、SARS-CoV-2 RBD IgM抗体ELISA试剂盒、SARS-CoV-2 N蛋白IgG抗体ELISA试剂盒和SARS-CoV-2 RBD IgG抗体ELISA试剂盒均购自同昕生物技术（北京）有限公司。检测仪器为SK201半自动酶标分析仪（深圳市盛信康科技有限公司）。

1.2.2 血清SARS-CoV-2抗体检测

采集所有对象静脉血2 mL，离心分离血清。所有血清检测前均经56 ℃灭活。根据试剂说明书，以2倍阴性对照值为Cut-off值，以S/CO＞1判定为阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。数据的正态性检验采用K-S检验。呈非正态分布的数据以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估各项指标诊断COVID-19的价值，以IgM抗体和IgG抗体任意一项阳性作为联合检测阳性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COVID-19组与对照组血清SARS-CoV-2 N蛋白抗体、SARS-CoV-2 RBD抗体的S/CO值比较

COVID-19组SARS-CoV-2 N蛋白IgM抗体、IgG抗体及SARS-CoV-2 RBD IgM抗体、IgG抗体的S/CO值均高于正常对照组（P＜0.05）和疾病对照组（P＜0.05）。见表1。

2.2 各项指标诊断COVID-19的价值

ROC曲线分析结果显示，SARS-CoV-2 N蛋白IgM抗体、IgG抗体、IgM+IgG抗体联合检测及SARS-CoV-2 RBD IgM抗体、IgG抗体、IgM+IgG抗体联合检测诊断COVID-19的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.949、0.991、0.992、0.994、0.999、0.999，见表2、图1。

表1 COVID-19组、疾病对照组及正常对照组4种血清SARS-COV-2抗体的S/CO值比较M（P25～P75）

SARS-CoV-2 RBD IgG抗体诊断COVID-19的敏感性高于SARS-CoV-2 N蛋白IgM抗体（P＜0.05），与其他各项指标之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。SARS-CoV-2 RBD IgG抗体诊断COVID-19的特异性与SARS-CoV-2 RBD IgM+IgG抗体联合检测差异无统计学意义（P＞0.05），与其他各项指标之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各项指标诊断COVID-19的效能

图1 各项指标诊断COVID-19的ROC曲线

3 讨论

本研究结果显示，SARS-CoV-2 N蛋白IgM抗体诊断COVID-19的敏感性最低，且低于N蛋白IgG抗体的检出率，其原因可能与患者采集样本时患病时间已较长[距离发病的时间为（20±5）d]有关。徐万洲等[2]的研究显示，在SARS-CoV-2 IgG抗体单阳性患者中，IgG抗体阳性的中位天数为24 d。患者此阶段因经过治疗或病情好转，IgM水平处于下降阶段，IgG水平处于维持阶段，所以在此时间段存在N蛋白IgM抗体转为阴性的可能。SARS-CoV-2 N蛋白的IgM抗体和IgG抗体的敏感性低于RBD-IgM抗体和IgG抗体，可能与这2种蛋白的特性相关。对SARS-CoV N蛋白和S蛋白的研究结果显示，N蛋白表达量较高，表达时间较早[7]，但S蛋白抗体的持久性优于N蛋白抗体。LI等[8]的研究结果显示，SARS-CoV N蛋白抗体水平在发病6个月内呈小幅下降，6～24个月时抗体水平显著下降；SARS-CoV S蛋白抗体在发病后的24个月内，抗体一直处于较稳定的水平。因此，SARS-CoV-2 N蛋白和S蛋白的抗体可能也具有类似的特点，但这需要收集SARS-CoV-2感染者不同时间段的样本进行抗体跟踪检测才能验证。N蛋白IgM抗体检测敏感性较低的缺点可以通过IgM和IgG联合检测进行克服。N蛋白IgM+IgG抗体联合检测诊断COVID-19的敏感性为97.4%，高于N蛋白IgM抗体的敏感性（82.1%）。

本研究结果还显示，SARS-CoV-2 RBD IgG抗体的特异性最高。原因可能与SARS-CoV-2的S蛋白和N蛋白与其他病毒的同源性不同相关。SARS-CoV-2与SARS-CoV的N蛋白序列相似性为94%，蛋白同源性很高，说明N蛋白比较保守，易于其他病毒发生交叉反应。WRAPP等[9]的研究结果显示，SARS-CoV-2 S蛋白与SARSCoV S蛋白的氨基酸序列相似度为76.47%；3种针对SARS-CoV RBD的多克隆抗体与SARSCoV-2的RBD完全没有结合力。由此可见，尽管SARS-CoV-2与SARS-CoV有较高的同源性，但二者RBD片段的交叉反应较少。因此，将S蛋白中的RBD作为抗原来检测血清中的抗体，对诊断SARS-CoV-2感染有较好的特异性。此外，SARS-CoV-2 RBD IgM抗体的特异性低于RBD IgG抗体的特异性（P＜0.05）。在正常对照组中，13份RBD IgM抗体假阳性样本的S/CO值为1.25（1.13～1.60），均为弱阳性样本，可能与血清中存在类风湿因子、嗜异性抗体、补体等干扰物质有关。

本研究的样本采集时间处于SARS-CoV-2感染的后期。ROC曲线分析显示，此阶段SARSCoV-2 RBD抗体的Youden指数高于N蛋白抗体。因此，对于已处于SARS-CoV-2感染后期的患者，采用S蛋白RBD抗体诊断COVID-19的临床价值更高，但在COVID-19早期诊断中的价值还需进一步研究。

综上所述，SARS-CoV-2 S蛋白RBD抗体检测在SARS-CoV-2感染后期的患者中价值更高。本研究的不足之处在于样本量较小，采样时患者发病时间已较长，未能动态监测SARS-CoV-2不同感染阶段抗体的变化。因此，本研究的结论还需大样本量进行验证。