血清维生素E结合蛋白及adropin蛋白在DN中的临床价值

田 茜， 李宝新， 李 娜， 郭淑芹， 张玛丽， 李 杰， 王 翯， 张云良

（1.承德医学院研究生学院，河北 承德 067000；2.保定市第一中心医院内分泌科 河北省光学感知技术创新中心，河北 保定 071000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的慢性微血管并发症之一，其特征为蛋白尿和不可逆性肾功能衰竭，最终导致终末期肾病[1]。尽管微量白蛋白（microalbumin，mAlb）尿是DN早期诊断的金标准，但并不能准确地预测DN的发生风险。因此，发现更早预测DN及预防肾功能衰竭的血清标志物成为研究热点[2]。DN的病情复杂多样，发病机制尚不明确，长期血糖、血脂控制不佳及胰岛素抵抗可能会导致DN病情加速进展[3]。维生素E结合蛋白（afamin，AFM）主要由肝脏合成，属于白蛋白超家族，可参与炎症免疫反应，同时调节血脂及胰岛素抵抗等代谢环节，影响血糖水平及体质量[4]。有研究结果显示，adropin蛋白（AD）是与代谢稳态相关的蛋白，具有延缓血管内皮细胞发生氧化应激，促进脂质代谢，提高血糖利用等作用[5-6]。AFM和AD可影响多种代谢途径，但在DN患者中的变化及影响因素尚不明确。为此，本研究拟探讨血清AFM及AD在DN患者中的临床价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016年12月—2018年12月于保定市第一中心医院内分泌科就诊的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者180例，其中男88例、女92例，参照1999年世界卫生组织推荐的T2DM诊断标准[7]确诊。参考世界卫生组织推荐的DN诊断标准[8]，根据尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin to creatinine ratio，UACR）将T2DM患者分为3组：（1）正常UACR组（UACR＜30 mg/g），共60例，其中男28例、女32例，年龄（55.47±8.55）岁；（2）低UACR组（UACR为30～＜300 mg/g），共61例，其中男31例、女30例，年龄（57.39±7.48）岁；（3）高UACR组（UACR≥300 mg/g），共59例，其中男29例、女30例，年龄（59.14±7.37）岁。排除标准：（1）合并急性糖尿病并发症；（2）合并原发性肾病；（3）合并急、慢性感染性疾病；（4）合并自身免疫系统性疾病、血液系统疾病、恶性肿瘤等；（5）心、脑血管疾病急性加重期。选取同期保定市第一中心医院体检健康者52名（正常对照组），其中男24名、女28名，年龄（55.46±7.17）岁。本研究获得保定市第一中心医院伦理委员会审核批准，所有对象均签署知情同意书。

1.2 方法

收集所有对象的一般资料，包括性别、年龄、血压、身高、体质量及糖尿病病程等，计算体质量指数（body mass index，BMI）。采集所有对象空腹8 h后的静脉血10 mL，分离血清。

空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、三酰甘油（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒均购自北京九强生物技术股份有限公司；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，Alb）试剂盒均购自北京利德曼生化股份有限公司；检测仪器为7600全自动生化分析仪（日本日立公司）。

T2DM患者清晨7点排空膀胱后，开始留取尿液至次日清晨7点的最后1次排尿，将尿液混匀后取10 mL[9]，采用BA400全自动特定蛋白分析仪（重庆博士泰生物技术有限公司）及配套试剂检测尿mAlb及24 h尿蛋白，计算尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion，UAE）、UACR。

采用HA8180全自动糖化血红蛋白分析仪测定糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）。采用cobas e601全自动电化学发光免疫分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂（电化学发光法）测定空腹胰岛素（fasting insulin，FINS），计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMAIR），公式为HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。

估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）的计算采用慢性肾脏疾病流行病学协作组（the Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration，CKD-EPI）公式[10]。女性：当SCr≤62 μmol/L时，eGFR=144×（SCr/62）-0.329×0.993年龄；当SCr＞62 μmol/L时，eGFR=144×（SCr/62）-1.209×0.993年龄；男性：当SCr≤80 μmol/L时，eGFR=141×（SCr/80）-0.411×0.993年龄；当SCr＞80 μmol/L时，eGFR=141×（SCr/80）-1.209×0.993年龄。

采用酶联免疫吸附试验测定血清AFM和AD水平。AFM试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，线性范围为7.8～500.0 mg/L，批内变异系数（coefficient of variation，CV）＜8%，批间CV＜10%。AD试剂盒购自上海酶联免疫生物有限公司，线性范围为12.5～400.0 pg/mL，批内CV＜10%，批间CV＜15%。严格按试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行分析。呈正态分布的计量资料以x±s表示，2个组之间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素或多因素方差分析。呈非正态分布的计量资料资料采用中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，2个组之间比较采用Nemenyi检验，多组间比较采用 Kruskal-WallisH检验。采用Spearman相关分析及多元逐步回归分析血清AFM和AD水平与各项指标的关系。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估AFM和AD诊断DN的价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T2DM各组及正常对照组之间一般资料的比较

正常UACR组、低UACR组、高UACR组及正常对照组之间年龄、性别、BMI、舒张压差异均无统计学意义（P＞0.05）。正常UACR组、低UACR组及高UACR组之间糖尿病病程差异无统计学意义（P＞0.05）。低UACR组及高UACR组收缩压高于正常UACR组及正常对照组（P＜0.05）。见表1。

2.2 T2DM各组及正常对照组之间血液指标的比较

与正常对照组比较，正常UACR组、低U A C R组、高U A C R组F B G、B U N、HbA1c、HOMA-IR升高（P＜0.05），TP降低（P＜0.05）。高UACR组HbA1c及HOMA-IR高于正常UACR组（P＜0.05），其他指标在T2DM各组之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。正常对照组、正常UACR组、低UACR组、高UACR组AFM水平依次升高，各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）；AD和Alb依次降低，各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。Alb除正常UACR组与低UACR组之间差异无统计学意义（P＞0.05）外，其他各组之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。4组之间TC、TG、AST及eGFR差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 T2DM各组及正常对照组之间一般资料的比较

表2 T2DM各组及正常对照组之间血液指标的比较 ±s

表2 T2DM各组及正常对照组之间血液指标的比较 ±s

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与正常UACR组比较，#P＜0.05；与低UACR组比较，△P＜0.05

组别 例数 FBG/（mmol/L） HbA1c/% FINS/（mU/L） HOMA-IR TC/（mmol/L）正常UACR组 60 8.91±2.81* 8.68±1.93* 10.46±3.97 4.16±2.08* 4.85±0.95低UACR组 61 9.59±3.36* 9.04±1.61* 11.15±4.03 4.82±2.62* 4.83±0.90高UACR组 59 9.87±3.47* 9.69±2.48*# 12.35±4.66*# 5.39±3.08*# 4.88±1.13正常对照组 52 5.42±0.42 4.72±0.60 9.60±2.36 2.32±0.61 4.92±0.66 F值 28.07 82.59 4.99 17.88 0.11 P值 0.00 0.00 0.00 0.00 0.95组别 TG/（mmol/L） AST/（U/L） TP/（g/L） Alb/（g/L） BUN/（mmol/L）正常UACR组 1.65±0.57 17.88±3.98 65.79±5.76* 42.73±3.75* 5.59±1.31*低UACR组 1.80±0.44 19.01±7.02 65.18±6.67* 42.06±3.91* 5.75±1.59*高UACR组 1.85±0.66 17.62±5.80 64.79±7.01* 39.79±5.04*#△ 6.30±2.31*正常对照组 1.67±0.42 19.34±5.15 68.89±5.50 49.93±6.01 4.59±1.14 F值 1.93 1.27 4.75 46.90 10.14 P值 0.13 0.29 0.00 0.00 0.00组别 SCr/（μmol/L） eGFR/[mL/（min·1.73 m2）] AFM/（mg/L） AD/（pg/mL）正常UACR组 63.03±9.79 100.92±12.37 80.51±27.00* 174.76±8.86*低UACR组 69.71±15.62# 98.78±18.71 99.55±24.67*# 158.36±12.01*#高UACR组 74.00±16.39*# 94.30±19.89 114.74±27.55*#△ 147.09±5.50*#△正常对照组 65.05±11.31 98.27±13.00 65.64±22.31 182.72±10.82 F值 7.59 1.68 39.67 157.85 P值 0.00 0.14 0.00 0.00

2.3 T2DM各组尿mAlb及UAE、UACR、24 h尿蛋白水平的比较

正常UACR组、低UACR组、高UACR组尿mAlb及UAE、UACR依次升高，各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。高UACR组24 h尿蛋白水平高于低UACR组、正常UACR组（P＜0.05）。见表3。

2.4 血清AFM和AD水平与其他指标的相关性分析

将尿mAlb、UAE、UACR及24 h尿蛋白进行对数转换，使其呈正态分布。Spearman相关分析结果显示，AFM与收缩压、BUN、SCr、FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、mAlb、UAE、UACR及24 h尿蛋白均呈正相关（r值分别为0.27、0.18、0.17、0.32、0.32、0.39、0.51、0.50、0.49、0.47、0.34，P＜0.05），与TP、Alb、AD均呈负相关（r值分别为-0.18、-0.32、-0.85，P＜0.05）。AD与TP及Alb均呈正相关（r值分别为0.19、0.45，P＜0.05），与收缩压、BUN、SCr、FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、mAlb、UAE、UACR、24 h尿蛋白及AFM均呈负相关（r值分别为-0.29、-0.29、-0.20、-0.46、-0.54、-0.36、-0.58、-0.72、-0.73、-0.73、-0.51、-0.85，P＜0.05）。

2.5 血清AFM及AD的影响因素

分别以AFM和AD为因变量，将Spearman相关分析中有相关性的项目作为自变量，进行多元线性回归分析。结果显示，血清AFM水平的影响因素为AD、HbA1c、UACR及24 h尿蛋白（β值分别为-0.90、0.11、0.16、0.11，P＜0.05），血清AD水平的影响因素为AFM、UACR及HbA1c（β值分别为-0.53、-0.45、-0.11，P＜0.05）。

表3 T2DM各组尿mAlb及UAE、UACR、24 h尿蛋白水平的比较 M（P25～P75）

2.6 血清AFM和AD诊断DN的效能

ROC曲线分析结果显示，血清AFM诊断DN的曲线下面积（area under curve，AUC）[95%（confidence interval，CI）]为0.80（0.75～0.86），最佳临界值为87.57 mg/L，敏感性和特异性分别为78.30%和71.50%。AD诊断DN的AUC（95%CI）为0.96（0.94～0.98），最佳临界值为171.86 pg/mL，敏感性和特异性分别为97.50%和92.00%。见图1。

图1 AFM和AD诊断DN的ROC曲线

3 讨论

DN是导致慢性肾功能不全的主要原因，目前全球DN的患病率呈上升趋势[11]。DN的自然发病过程包括肾小球高滤过、进行性Alb尿、肾小球滤过率下降以及最终的终末期肾病（endstage renal disease，ESRD）。尽管ESRD可能是DN最容易识别的结果，但大多数患者在需要肾脏替代治疗前已死于并发的心血管疾病和感染[12]。因此，临床亟需敏感的血清学标志物来尽早预测DN的发生，以改善DN患者的预后。

AFM是人类Alb基因家族的第4个成员，相对分子质量为87 000，主要由肝脏表达，同时也在肾脏、脑、睾丸和卵巢等组织和器官中表达[13]。有研究结果显示，在转基因小鼠体内过量表达人类afamin基因后，小鼠体质量增加，血清脂质和葡萄糖水平升高[14]。一项有20 000名个体参与的研究结果显示，血清AFM水平与T2DM的患病率及胰岛素抵抗密切有关。本研究结果显示，与正常对照组比较，T2DM各组AFM水平均升高（P＜0.05），且AFM与HOMA-IR呈正相关（r=0.51，P＜0.05），与文献报道[15]一致。AFM可通过上调葡萄糖代谢的关键酶和产物来使血糖水平升高，改变血脂分布，进而出现血压升高、BMI增大等多种代谢综合征表现，这些表现在DN的发生、发展中发挥了至关重要的作用。KABURAGI等[16]的研究结果显示，DN患者尿液AFM/Cr比值明显高于单纯T2DM患者，提示尿液AFM水平与DN的进展有关。本研究结果显示，随着UACR水平的升高，T2DM各组的AFM水平依次升高，且以高UACR组为最高，提示随着DN病情的进展，AFM水平逐渐升高。这可能与肾脏AFM表达增加，导致DN病情进展及肝脏AFM表达增加，引起胰岛素抵抗有关。相关性分析及多元线性回归分析结果显示，AFM与长期血糖控制情况、胰岛素抵抗、肾脏功能及Alb合成密切相关。AFM或可通过影响血糖水平及加重尿蛋白丢失情况，进一步加重DN患者的病情。因此，AFM可间接反映DN病情的严重程度。

AD是Enho基因编码的，由76个氨基酸组成的肽类激素，主要在肝脏和中枢神经系统中表达[17]。AD是一种调节细胞-细胞通讯的膜结合蛋白，同时可存在于各种组织和体液中。AD参与了碳水化合物及脂质调节、能量稳态调节，与胰岛素抵抗、中枢神经系统功能及内皮细胞功能密切相关[18]。有研究结果显示，T2DM患者血清AD水平下降，可能与AD抑制体质量增加、增加胰岛素敏感性、影响糖代谢和脂代谢有关[19]。动物实验结果显示，用AD治疗可以降低链脲佐菌素诱导的T2DM大鼠模型的血糖水平并改善胰岛素抵抗[20]。本研究结果显示，正常UACR组AD水平低于正常对照组（P＜0.05），且高UACR组高于低UACR组和正常UACR组，说明DN与AD密切相关。相关性分析结果显示，AD与收缩压、BUN、SCr、FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、mAlb、UAE、UACR、24 h尿蛋白均呈负相关（r值分别为-0.29、-0.29、-0.20、-0.46、-0.54、-0.36、-0.58、-0.72、-0.73、-0.73、-0.51，P＜0.05），提示AD可能通过调节患者血糖控制水平、胰岛素水平及胰岛素敏感性等方面来抑制糖尿病的发展，进而延缓糖尿病相关代谢变化导致的肾功能损伤。多元线性回归分析结果显示，影响AD表达的因素为AFM、UACR及HbA1c，提示DN患者随着UACR水平的升高，AD逐渐降低，且与DN病变的严重程度相关。ROC曲线分析结果显示，AFM及AD对DN的诊断均有一定的价值。

综上所述，在DN患者中，随着UACR水平的升高，AFM水平逐渐升高，AD水平逐渐下降，AFM和AD对DN均有一定的诊断价值。由于本研究的样本量较小，相关结论需扩大样本量进一步验证，具体机制也需进一步研究。