284例非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞与临床特征及凝血功能的相关性*

朱丽华，周蕾，罗斌，欧阳怡然，范瑞，陆恩昊，李和根，田建辉

200032 上海，上海中医药大学附属龙华医院 肿瘤科(朱丽华、周蕾、罗斌、欧阳怡然、范瑞、陆恩昊、李和根、田建辉)；200032 上海，上海市中医药研究院 中医肿瘤研究所(田建辉)

肺癌是世界范围内癌症死亡率最高的恶性肿瘤，2018年全球有176万人死于肺癌，占癌症总死亡率的18.4%[1]。肺癌中80%左右的患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)[2]，Ⅰ～Ⅲa期NSCLC患者首选手术治疗，但总体5年生存率仍仅为23%[3]。手术后复发转移是影响预后的关键。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC) 被认为是“转移的种子”，原发肿瘤形成的CTC通过血液循环进一步播散至远处器官，最终定植并增殖[4]。恶性肿瘤患者通常都存在凝血功能异常[5-6]，高凝状态与肿瘤的形成、转移等存在密切关系[7]。临床研究发现血液高凝状态可能促进了胃癌CTC的远处转移[8],在肝癌、肺癌中也有凝血功能障碍促进CTC远处转移的报道[9-10]。因此本研究将通过来自于临床的NSCLC患者病例资料，分析CTC表达与NSCLC临床特征及其与血小板(platelet,PLT)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶时间(thrombin time,TT)、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)、纤维蛋白降解产物(fibrin degradation products,FDP)、D-二聚体(D-dimer,D-D)等凝血功能的关系，探索CTC与NSCLC凝血功能状态、转移的相关性。

1 对象与方法

1.1 诊断标准

本研究依据国家卫生部发布的《中国原发性肺癌诊疗规范(2015)》中原发性支气管肺癌的诊断标准[11]。肺癌分期标准采用国际肺癌研究学会(International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC)2009年修订的第7版TNM分期[12]。

1.2 病例来源

研究对象来源于上海中医药大学附属龙华医院(189例)、上海市胸科医院(44例)、上海市第六人民医院(11例)、上海市华东医院(14例)、上海中医药大学附属中西医结合医院(26例)住院或门诊患者。上海中医药大学附属龙华医院伦理委员会已批准此项研究(批件号：SHDC1201611)。

1.3 一般资料

课题组纳入了2016年3月至2019年3月收治的NSCLC患者284例，其中男性163例(57.4%)，女性121例(42.6%)；中位年龄63岁(范围：28～83岁)；病理类型中，腺癌219例(77.1%)、鳞状细胞癌46例(16.2%)、腺鳞癌5例(1.8%)、大细胞癌8例(2.8%)、其他类型6例(非小细胞2例、低分化神经内分泌癌2例、淋巴上皮瘤样癌1例、肉瘤样癌1例)；依据IASLC第七版TNM分期为Ⅰb期73例(25.7%)、Ⅱa期33例(11.6%)、Ⅱb期47例(16.5%)、Ⅲa期49例(17.3%)、Ⅲb期14例(4.9%)、Ⅳ期68例(23.9%)(表1)。

表1 非小细胞肺癌患者临床特征分布Table 1. Clinical Characteristics of Patients with NSCLC

1.4 观察指标及方法

1.4.1 CTC检测方法 所有标本均由本院肿瘤研究所专业人员完成，双人核对。1)采集的血液在24 h内完成 CD45磁珠富集去除白细胞。具体操作方法参照有关文献[13-14]。经免疫磁珠阴性法富集后，开始染色体原位杂交，利用8号染色体着丝粒探针标记细胞[15],免疫荧光染色后再进行复染；2)CTC计数：CTC阳性标准，通过杂交信号判断是否存在超二倍体细胞，8号染色体拷贝数为2个(绿色荧光标记探针)，判定为正常细胞(二倍体细胞)；拷贝数为>2个，判定为肿瘤细胞(超二倍体细胞)。CTC计数≥2个，定义为CTC阳性[16]。

1.4.2 血小板及凝血功能检查方法 由医院检验科生化实验室专业人员检测，抽取研究病例晨空腹肘静脉血4 mL，PLT、PT、APTT、TT、FIB、FDP、D-D通过自动血细胞分析仪及配套设备。

1.5 统计方法

2 结 果

2.1 CTC与NSCLC患者临床特征的关系

CTC阳性组与阴性组在性别、年龄、有否远处转移的构成上无显著差异；两组在病理类型构成上差异显著，腺癌阳性率78.1%，鳞状细胞癌阳性率60.1%，腺鳞癌40%，大细胞癌62.5%，腺癌患者的阳性率高于其他类型(P<0.05)；不同的TNM分期，CTC阳性组与阴性组构成差异显著(P<0.05)(表2、图1)。

表2 非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞表达与临床特征的关系Table 2. Association of Clinicopathologic Features with CTC Expressions

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图1 不同TNM分期CTC表达变化Figure 1. CTC Expressions in Different TNM Stages of NSCLCThe CTC positive rate was 69.9% in stage Ⅰb NSCLC, 62.5% in stage Ⅱ NSCLC, 84.1% in stage Ⅲ NSCLC and 80.9% in stage Ⅳ NSCLC. The CTC positive rates in stage Ⅲ NSCLC and stage Ⅳ NSCLC were higher than those in stage Ⅰb NSCLC or stage Ⅱ NSCLC (P=0.012).

2.2 CTC与NSCLC患者临床特征的二元Logistic回归分析

二元Logistic回归模型在调整了性别、年龄、病理类型、TNM分期等因素后，发现TNM分期与外周血CTC阳性表达呈正相关(P<0.05；95%CI: 1.034～1.708)，提示随着TNM分期增高，患者的外周血CTC阳性率显著增加。在病理类型方面，与腺癌相比，其他病理类型的患者外周血CTC阳性率显著降低(P<0.05，95%CI: 0.481～0.894)，提示本研究中腺癌患者外周血CTC阳性率更高(表3)。

表3 非小细胞肺癌患者临床特征与CTC阳性表达的二元Logistic回归模型分析Table 3. Analysis of Clinical Characteristics and CTC Levels by Binary Logistic Regression Model

2.3 CTC与血小板、凝血功能的关系

本研究中血小板、凝血功能指标均不满足正态分布，采用非参数检验。CTC阳性组与CTC阴性组之间PLT、D-D、FDP、FIB、TT、APTT差异无统计学意义；CTC阳性的肺癌患者的PT水平显著低于CTC阴性肺癌患者(P<0.05)，提示PT与CTC可能存在一定联系(表4)。

表4 CTC阳性组与CTC阴性组凝血指标中值的比较[M (IQR)]Table 4. Coagulation Indicators of Patients with Different CTC Expressions [Median (IQR)]

2.4 远处转移与血小板、凝血功能的关系

有远处转移的NSCLC患者FDP、FIB、PT水平均显著高于无远处转移的患者(P<0.05)，TT水平均显著低于无远处转移患者(P<0.05)(表5)。

表5 有远处转移者与无远处转移者凝血指标中值的比较[M (IQR)]Table 5. Coagulation Indicators of Patients with or without Distant Metastasis [Median (IQR)]

2.5 凝血功能与CTC及转移的相关性检验

经相关性检验，CTC阳性表达率与PT呈负相关(r=-0.128，P<0.05)；FDP、FIB、PT与转移呈正相关(P<0.05)，TT与转移呈负相关(r=-0.281，P<0.05)；FIB(r=0.163，P<0.05)、PT(r=0.144，P<0.05)与TNM分期呈正相关，TT与分期呈负相关(r=-0.242，P<0.001)。

3 讨 论

CTC是一种潜在的肿瘤标志物，可以作为“液体活检”的样本，与传统的活组织检查相比，其具有微创、可反复检测等优点。研究证实CTC的存在与肿瘤早期转移[17]、疗效反应[18]及临床预后[19]等密切相关，并且CTC已被纳入美国癌症联合会第八版乳腺癌分期系统[20]。在肺癌研究方面，有报道应用膜过滤法检测良性肺部疾病CTC检出率仅5%，肺癌检出率高达90%[21];另一项研究在可手术切除的肺癌患者中使用CellSearch技术，检出肺静脉中CTC阳性率为48%[22]，提示CTC检测在肺癌中具有一定敏感性。本研究应用免疫磁珠阴性富集法检测多中心、较大样本量的NSCLC患者外周血CTC，发现284例中有209例患者CTC检出阳性，检出率为73.6%。

3.1 CTC在NSCLC中的表达规律

本研究结果显示CTC阳性率与NSCLC临床TNM分期相关，而在不同年龄、性别的患者中差异无统计学意义，其中Ⅰb期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTC阳性率分别为69.9%、62.5%、84.1%、80.9%，Ⅲ期、Ⅳ期患者的CTC阳性率显著高于Ⅰb期、Ⅱ期，差异有统计学意义，提示随着NSCLC分期越晚，CTC阳性表达率越高。秦子敏等[23]同样应用阴性免疫磁珠富集法检测87例肺癌患者，发现Ⅲ+Ⅳ期患者CTC水平显著高于Ⅰ+Ⅱ期患者。Zhang等[24]应用阳性免疫磁珠富集法检测了91例肺癌患者，Ⅲ期检出率为25%、Ⅳ期为69.3%；本研究与国内外文献报道相符，从图1可以看出Ⅲ期、Ⅳ期NSCLC的CTC显著升高，进一步说明CTC可能与肺癌发展以及严重程度具有密切联系。

其次本研究发现肺腺癌患者的CTC阳性率78.1%，高于鳞癌(60.8%)及其他非小细胞类型，排除TNM分期构成的差异，可能与腺癌病例数(77.11%)较多有关。曾有研究发现CTC在表皮生长因子受体突变患者中表达更高，可能是腺癌检出率高的原因[25]；也有报道提示，在NSCLC仅腺癌中术后CTC水平是无进展生存(progression-free survival,PFS)的独立预后因素[26]，但在多中心进一步扩大样本量后并未发现差异[27]。

3.2 晚期肺癌存在高凝状态

恶性肿瘤患者通常存在凝血功能障碍[28-29]，在高凝状态下极易形成血栓，动静脉血栓的形成进一步增加患者死亡风险，且对肿瘤细胞的增殖、浸润与转移又有促进作用。肿瘤细胞在其发生发展的过程中会通过多种途径打破机体凝血与纤溶系统的平衡。首先肿瘤细胞自身能释放促凝活性的物质如组织因子(tissue factor，TF)、癌促凝物质等形成凝血酶原激活物；其次炎性细胞因子如VEGF、IL-1、TNF-α等，促使纤溶酶原激活物的抑制物在内皮细胞表达，加速血液高凝状态的形成，共同使机体处于高凝状态。再者肿瘤细胞会与PLT、内皮细胞、单核巨噬细胞相互作用，PLT会释放出ADP、5-HT、花生四烯酸、黏附蛋白分子等促进血液凝固的活性物质，进一步导致高凝状态的形成。

本研究分析了NSCLC患者血浆凝血功能指标及血小板，发现FIB、PT、TT与临床分期相关，FIB、PT与分期呈正相关，TT与分期呈负相关。多项研究证实FIB、PT的延长均与肺癌患者的不良预后相关[28,30]。FIB是肝脏合成和分泌的蛋白，含量在所有的凝血因子中最高。血浆FIB水平与肿瘤的病理分期和对治疗的反应密切相关，较高的FIB水平可预测TNM及淋巴结转移，且是肺癌的生存期(overall survival,OS)、PFS的预后危险因素[31]。本研究显示，有远处转移患者FDP、FIB延长，TT缩短，说明高凝状态有助于促进肿瘤细胞的侵袭和转移[32]。

3.3 高凝状态增强CTC抵抗能力促进转移

正常情况下，单个CTC从原发性肿瘤进入循环系统后，面临无数生存挑战，例如T细胞和自然杀伤细胞的攻击、剪切力和氧化应激等[33]，然而高凝状态的血液可以保护肿瘤细胞免受上述风险的侵害[34-36]，可能原因是CTC具有在早期转移过程中启动凝血激活的潜在作用[37]。研究发现肿瘤细胞、血小板和纤维蛋白等聚集形成免疫瘤栓，它可包裹原发肿瘤细胞、有助于肿瘤细胞躲避机体免疫系统的识别[38-39]，因此凝血系统激活的微环境，有利于CTC在血管内存活，形成转移。研究者们前期在胃癌中发现血液高凝状态可能促进了胃癌CTC的远处转移，治疗前检测CTC指标对预测胃癌患者的预后有重要意义；晚期不可切除胃癌患者CTC与患者高凝状态、疾病进展相关,可能存在CTC-高凝-转移的恶性循环,积极抗凝及抗肿瘤治疗可能阻断这一恶性循环,改善高凝状态减少转移[40]。

本研究中Ⅲb+Ⅳ期患者CTC阳性率为84.1%，显著高于Ⅰb～Ⅲa期患者(P<0.05)，而Ⅲb+Ⅳ期患者即为N2～N3或M1的患者，即存在纵膈淋巴结转移或远处转移，提示有转移的患者CTC阳性率增高。此外我们发现有远处转移(M1)的NSCLC患者FDP、FIB延长，TT缩短，存在高凝状态，提示高凝状态有助于CTC的存活促进转移。有研究发现肺癌患者外周血中CTC指标可准确预测肺癌的远处转移,而机体血液处于高凝状态下易促使肺癌远处转移发生[41]，影响患者预后[42]。因此凝血功能异常可能促进NSCLC CTC的远处转移。

然而本研究不足之处在于，尚缺乏免疫细胞的检测以充分证实免疫系统和凝血功能共同影响CTC转移的作用，其次尚缺乏病例预后随访数据，以明确CTC对OS的影响。

综上所述，CTC与NSCLC TNM分期相关，CTC表达阳性患者存在凝血功能异常，高凝状态与NSCLC的转移相关，高凝状态可能促进CTC的转移。改善高凝状态、促进CTC清除可能是预防肺癌转移的有效方法。

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