土家药红黑二丸质量标准研究
2020-12-03杨德泉佘永红
杨德泉，佘永红
湘西土家族苗族自治州食品药品检验所，湖南 吉首 416000
红黑二丸，又名红白二丸、岩丸子、鸳鸯七、山海棠，是一味土家族常用药材，土家语称捏龙免姐［1］。土家医药理论认为，红黑二丸性微冷，味酸、辣。具有赶火止泻，活血疗伤，止血等功效。土家医临床用于热泻症、心口痛、跌打伤痛、血热出血、痢疾、淋浊、白浊、毒蛇咬伤等病症［2,3］。红黑二丸中含有β-谷甾醇、豆甾醇、表儿茶酸、表儿茶醛、表儿茶素、儿茶素等成分［4-6］。红黑二丸虽常用于土家族医临床，但尚无质量标准。为控制红黑二丸药材质量，笔者通过民间用药调查，参考有关文献［7-10］，对其性状、显微结构进行鉴别研究，建立了以β-谷甾醇为成分指标的TLC鉴别方法及HPLC含量测定方法，为建立红黑二丸药材的质量标准提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪［包括VWD检测器，Rev.B.03（16）化学色谱工作站］；AUW 220D电子天平；RMZ126RT型石蜡切片机［型号：RM2126RT，徕卡显微系统（上海）有限公司］；OLYMPUS BX61电动显微镜；超声波清洗器（型号：KQ5200型，昆山市超声仪器有限公司）；SONY数码单反相机（型号：DSLR-A450，索尼公司）。
1.2 试药
β-谷甾醇（批号110851-201608，供含量测定用，含量以97.0%计）购自中国食品药品检定研究院。硅胶G薄层板购于德国化工技术（上海）有限公司和青岛海洋化工厂分厂。乙腈、异丙醇为色谱纯，水为纯净水，其余均为分析纯。红黑二丸药材经杨德泉主任药师鉴定为中华秋海棠Begonia grandisDry.subsp.Sinensis（A.DC.）Irmsch.。
2 方法与结果
2.1 药材性状鉴别
块茎呈扁圆球形或不规则块状，直径0.7～3.0 cm。表面棕红色至黑褐色，有不规则的皱纹。上端凹凸窝状，偶有叶柄残留须根。质坚实，不易折断，断面类白色或淡红棕色，粉性，散在微小的亮星。气微、味微苦。见图1。
2.2 显微鉴别
2.2.1 根茎横切片木栓细胞4～6列，切向延长、表面观长方形或多角形。木栓细胞外侧有时可见表皮细胞，表皮细胞外侧附有角质层，表皮细胞内侧常有受到挤压的薄壁细胞。木栓层内为薄壁细胞区，其内散生维管束，维管束中导管束明显，可见形成层和韧皮部，但形成层大多不明显。皮层、中柱和髓部无明显分界。薄壁细胞中含淀粉粒，有的含有簇晶或集合成簇状的细小针晶群。显微结构见图2。
2.2.2 粉末特征粉末浅黄棕色。淀粉粒众多，单粒，圆形、椭圆形，层纹明显，脐点点状，直径15～30 nm。草酸钙针晶细小而多，呈簇状存在，簇状团块直径20～30 nm，可见簇晶。导管为环螺纹，直径25～35 nm。木栓化细胞多角形，壁略平直。残存的表皮细胞上偶见单细胞腺毛，内含红棕色分泌物，直径15～25 nm。显微特征见图3。
2.3 薄层色谱鉴别
取红黑二丸粉未（过4号筛）0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20 mL，超声提取30 min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇适量溶解，转移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得供试品溶液；另称取β-谷甾醇10 mg置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环已烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20∶5∶8∶0.1）为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃烘至斑点显色清晰。样品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见图4 。
2.4 HPLC含量测定
2.4.1 色谱条件色谱柱：Agilent 5 TC C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-异丙醇（70∶30）；流速：0.8 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃，进样量：20 μL。
2.4.2 对照品溶液的制备精密称取β-谷甾醇20.40 mg,置20 mL容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，作为β-谷甾醇的标准储备溶液，浓度为0.989 mg/mL。精密吸取标准储备溶液3 mL置于50 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，制成每1 mL含59.34 μg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
2.4.3 供试品溶液的制备取本品粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，加乙醇25 mL，超声处理40 min，放冷，过滤，滤液挥干，加乙醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。同步称取样品粉末，测定水分，按干燥品计算含量。
2.4.4 阴性样品溶液的制备取乙醇25 mL，置50 mL锥形瓶中，同供试品溶液制备方法操作，即得。
2.4.5 系统适用性试验按“2.4.1”色谱条件测定，样品中β-谷甾醇与其他组分的色谱峰分离度大于1.5，与对照品对应的色谱峰的理论板数不低于16 000。供试品色谱中，在与对照品色谱峰相应位置上检出色谱峰。对照品、样品及阴性样品色谱图见图5。
2.4.6 线性关系考察精密吸取β-谷甾醇的标准储备溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，混匀，得197.8 μg/mL的溶液，再分别精密吸取0.5、1、2、3、5、10 mL，置10 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，配制成9.89、19.78、39.56、59.34、98.9、197.8 μg/mL的系列对照品溶液。
分别精密吸取上述系列对照品溶液20 μL，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归处理，得β-谷甾醇的回归方程：Y=335.73X+3.401 5，r=0.999 9。结果表明：β-谷甾醇进样量在0.197 8～3.956 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.4.7 精密度实验取同一浓度对照品溶液，连续进样6次，β-谷甾醇峰面积的RSD为0.65%。
2.4.8 重复性实验取采于吉首市寨阳村样品6份，分别按样品测定法测定。测定含量分别为0.271 1、0.268 2、0.275 2、0.266 9、0.266 0、0.267 8 mg/g，平均含量为0.269 2 mg/g，RSD为1.2%。
2.4.9 稳定性试验取同一供试品溶液，于0、1、4、6、12 h，进样测定峰面积，结果RSD为1.2%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。
2.4.10 加样回收率试验取采于吉首市寨阳村的样品（含量为0.269 2 mg/g）6份，置50 mL锥形瓶中,分别吸取浓度为0.059 34 mg/mL的β-谷甾醇标准储备溶液1.1 mL，按供试品溶液的方法制备。照“2.4.1”项下色谱条件测定，平均回收率为97.3%，RSD为2.9%。结果见表1。
2.5 样品含量测定
精密称取不同批次的红黑二丸药材粉末（过3号筛）0.5 g，按“2.4.3”项下下方法制备供试品溶液，并按“2.4.1”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，用外标法计算出β-谷甾醇的含量，11批样品含量测定结果见表2。
表1 回收率试验结果
表2 红黑二丸中β-谷甾醇含量
3 讨论
民族药质量标准的研究建立，是合理、安全、有效应用民族药的保证，对民族药走向现代化有极其重要的意义。本文通过对红黑二丸药材的性状、显微、薄层色谱、含量测定的研究，为建立红黑二丸药材标准提供科学依据。β-谷甾醇具有保护胃黏膜［11］、促凝血、活血化瘀、抗炎镇痛、止泻等［12］药理活性，与土家医临床应用红黑二丸治疗热泻症、心口痛、跌打伤痛、血热出血、痢疾等病症相符合。选择β-谷甾醇作为红黑二丸药材标准的指标性成分，使该药质量评价模式和标准关联，为民族药临床应用提供了科学理论支撑。
