骨疏宁口服液的薄层鉴别和含量测定方法研究*

吴勇梅，何 科，徐 锦，韦玉燕

(玉林市中西医结合骨科医院，广西 玉林 537000)

骨疏宁方是我院名老中医赖祥林的验方，由淫羊藿、骨碎补、制何首乌、丹参、续断等19味中药组成，具有益阴助阳，补肾壮阳、活血化瘀、通络镇痛等功效，主治老年骨质疏松所致之腰腿疼痛，颈痿肩累，周身痿痛，肢体乏力，失眠健忘，夜尿多等症[1]，疗效确切。该方原剂型为片剂[2]，为了满足不方便吞咽片剂的患者需求，将其增加液体剂型为骨疏宁口服液。前期已完成骨疏宁口服液的工艺研究[3]，为有效控制该制剂的质量，本实验采用TLC对处方中主药淫羊藿、骨碎补、续断和丹参药材进行定性鉴别；淫羊藿骨碎补为方中君药，有效成分分别为淫羊藿苷和柚皮苷，具有确切的抗骨质疏松和促进骨愈合的作用[4-5]，因此淫羊藿苷和柚皮苷的含量可作为评价骨疏宁口服液质量的指标之一，采用 HPLC 同时测定淫羊藿苷和柚皮苷的含量。本实验方法操作简便、准确性高、重现性好，为骨疏宁口服液的质量标准提供有效检测方法。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

U3000高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技有限公司；XS-205Du型电子分析天平，瑞士梅特勒公司；Millipore Simplicity-UV超纯水器，美国密里博公司；SB3200-T超声波清洗器，上海必能信超声公司；硅胶G薄层板，青岛海洋化工厂；聚酰胺薄膜，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂。

1.2 材 料

骨疏宁口服液，批号：20180103、20180104、20180108、20180109、20180110、20180111，玉林市中西医结合骨科医院自制；对照品淫羊藿苷(批号110737-200415)、柚皮苷(批号110722-200309)、川续断皂苷Ⅵ(批号：111685-201003)、丹酚酸B(批号：111562-201111)和对照药材淫羊藿(批号：121632-201101)、骨碎补(批号：121169-200503)、丹参(批号：120923-200408)、续断(批号：121033-200304)均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈(色谱纯)，Fisher公司；冰醋酸(色谱纯)，西陇化工股份有限公司；其他试剂均为分析纯，高效液相色谱仪用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 淫羊藿的TLC鉴别

取骨疏宁口服液20 mL，加水饱和的正丁醇20 mL振摇提取，分取正丁醇液，重复提取一次，合并2次正丁醇液，用40 mL氨试液洗涤，取正丁醇液，重复洗涤1次，取正丁醇液用40 mL正丁醇饱和的水洗涤，分取正丁醇液，重复洗涤1次，取正丁醇液在水浴上蒸干得残渣，加甲醇1 mL使溶解得供试品溶液。按处方比例分别称取除淫羊藿以外的药味，按制备工艺制备阴性样品，同供试品提取方法制得缺淫羊藿阴性对照品溶液。取淫羊藿对照药材0.5 g，加水煎煮2次，每次加50 mL水煎煮1 h后滤过，合并滤液，在水浴上浓缩成大约30 mL的溶液，同供试品提取方法制成对照药材溶液。取淫羊藿苷对照品加甲醇溶解，制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。分别取上述四种溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板，用展开剂甲醇-丁酮-三氯甲烷-水-甲酸(4：6：6：1：0.5)溶液展开，取出晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，用热风吹干后在紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的、清晰的荧光斑点，阴性样品对照无干扰，说明本鉴别方法可行。结果见图1。

图1 淫羊藿的TLC鉴别色谱图

2.1.2 续断的TLC鉴别

取2.1.1淫羊藿TLC鉴别项下的供试品溶液作为供试品溶液。取续断对照药材1 g，加水煎煮2次，每次加50 mL水煎煮1 h后滤过，合并滤液，在水浴上浓缩成大约20 mL的溶液，按2.1.1淫羊藿TLC鉴别项下制备供试品溶液的方法制成对照药材溶液。取续断皂苷Ⅵ对照品加甲醇溶解，制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。按处方比例分别称取除续断以外的药味，按制备工艺制备阴性样品，同供试品提取方法制得缺续断阴性对照品溶液。分别取上述四种溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板，以展开剂三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)10 ℃冷藏过夜的下层溶液展开，取出晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，然后置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色、清晰的主斑点，阴性样品对照无干扰，说明本鉴别方法可行。结果见图2。

图2 续断的TLC鉴别色谱图

2.1.3 骨碎补的TLC鉴别

取骨疏宁口服液20 mL，加乙酸乙酯20 mL振摇提取，重复1次，合并乙酸乙酯液，在水浴上蒸干得残渣，加甲醇1 mL使溶解得供试品溶液。按处方比例分别称取除骨碎补以外的药味，按制备工艺制备阴性样品，同供试品提取方法制得缺骨碎补阴性对照品溶液。取骨碎补对照药材1 g，加水煎煮2次，每次加50 mL水煎煮1 h后滤过，合并滤液，在水浴上浓缩成大约20 mL的溶液，同供试品提取方法制成对照药材溶液。取柚皮苷对照品适量加甲醇溶解，制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。分别取上述四种溶液各10 μL点于同一聚酰胺薄膜，以展开剂三氯甲烷-丙酮-甲醇(4：1：1)溶液展开，取出晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，在紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的、清晰的荧光斑点，阴性样品对照无干扰，说明本鉴别方法可行。结果见图3。

图3 骨碎补的TLC鉴别色谱图

2.1.4 丹参的TLC鉴别

取骨疏宁口服液10 mL，加15 mL石油醚(60～90 ℃)振摇提取，取水层加稀盐酸调节pH值至2～3，再加乙醚10 mL振摇提取，重复1次，合并乙醚液，挥干乙醚得残渣，加甲醇5 mL使溶解得供试品溶液。按处方比例分别称取除丹参以外的药味，按制备工艺制备阴性样品，同供试品提取方法制得缺丹参阴性对照品溶液。取丹参对照药材0.1 g，加水煎煮2次，每次加50 mL水煎煮1小时后滤过，合并滤液，在水浴上浓缩成大约20 mL的溶液，同供试品提取方法制成对照药材溶液。取丹酚酸B对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液。分别吸取上述四种溶液各1～2 μL，点于同一聚酰胺薄膜，使成条状，以展开剂丙酮-水-甲酸(40：10：1)展开，取出晾干，放置氨气中熏15秒钟，在紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的、清晰的荧光主斑点，阴性样品对照无干扰，说明本鉴别方法可行。结果见图4。

图4 丹参的TLC鉴别色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适应性试验

色谱柱为C18柱(Agilent EtlipseXDB-C18，5 μm，4.6×150 mm)，流动相为乙腈-0.5%冰醋酸溶液梯度洗脱(乙腈体积分数在0～20 min为15%～60%)，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃，检测波长为285 nm，进样量为10 μL。在此条件下，以柚皮苷峰计算理论塔板数应不低于5000。

2.2.2 对照品溶液制备

精密称取柚皮苷0.01039 g和淫羊藿苷对照品0.01007 g，分别置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得柚皮苷对照品贮备液和淫羊藿苷对照品贮备液。分别精密量取2 mL贮备液置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得每1 mL含柚皮苷0.1039 mg、含淫羊藿苷0.1007 mg的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备

精密量取骨疏宁口服液10 mL，置聚酰胺层析柱(100～200目，6 g，内径为1.5 cm)上，用蒸馏水100 mL洗脱，水洗液弃去，再用95%乙醇100 mL洗脱，收集醇洗脱液，蒸干得残渣，用甲醇溶解，定量转移至10 mL量瓶中并定容，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液制备

按处方比例分别称取除骨碎补和淫羊藿以外的其余药味，按制备工艺制备阴性样品，按“2.2.3供试品溶液制备”方法制备阴性对照溶液。

2.2.5 测定方法

分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各10 μL，在上述色谱条件下，供试品中柚皮苷和淫羊藿苷色谱峰与对照品色谱峰保留时间一致，与其它成分的分离度大于1.5。色谱图见图5(a)～图5(c)。

图5 对照品(a)，供试品(b)和阴性对照(c)的HPLC色谱图

2.2.6 线性关系考察

分别精密吸取上述柚皮苷和淫羊藿苷混合对照品溶液(每1 mL含柚皮苷0.1039 mg、含淫羊藿苷0.1007 mg)1、5、10、15、20、25 μL，进样测定柚皮苷和淫羊藿苷峰面积，以进样量(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，得柚皮苷回归方程：y=229.3x+2.032，r=0.9993；淫羊藿苷回归方程：y=176.8x+0.175，r=0.9999。结果表明柚皮苷对照品进样量在0.1039～2.5975 μg之间与峰面积值呈现良好的线性关系，淫羊藿苷对照品进样量在0.1007～2.5175 μg之间与峰面积值呈现良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验

精密量取骨疏宁口服液10 mL，按“2.2.3供试品溶液制备”方法制备，精密吸取10 μL，按2.2.1项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，结果柚皮苷平均峰面积值为296.812，RSD为0.4%，淫羊藿苷平均峰面积值为221.486，RSD为0.3%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验

取上述供试品溶液，每次精密吸取10 μL，分别于1，2，4，6，12，24 h进样，按2.2.1项下色谱条件测定柚皮苷和淫羊藿苷峰面积并计算其含量，在24 h内柚皮苷平均含量为0.1279 mg·mL-1，RSD为1.6%，淫羊藿苷平均含量为0.1242 mg·mL-1，RSD为0.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验

取同一批号骨疏宁口服液6份，分别精密量取10 mL，按“2.2.3供试品制备”方法制备，精密吸取10 μL，进样按2.2.1项下色谱条件测定柚皮苷和淫羊藿苷峰面积并计算其含量，结果柚皮苷平均含量为0.1340 mg·mL-1，RSD为4.0%，淫羊藿苷平均含量为0.1250 mg·mL-1，RSD为1.0%。表明本法重复性良好。

2.2.10 加样回收试验

取已知含量(柚皮苷含量为0.1340 mg·mL-1，淫羊藿苷含量为0.1250 mg·mL-1)的骨疏宁口服液6份，每份精密量取5 mL，分别加入一定量的柚皮苷和淫羊藿苷对照品，按“2.2.3供试品溶液制备”方法处理，精密吸取10 μL，进样按2.2.1项下色谱条件测定柚皮苷和淫羊藿苷峰面积并计算回收率，柚皮苷平均回收率为99.70%，RSD为1.4%，淫羊藿苷平均回收率为99.78%，RSD为1.2%，表明本法系统误差较小。结果见表1、表2。

表1 供试品柚皮苷回收率试验结果

表2 供试品淫羊藿苷回收率试验结果

2.2.11 样品含量测定

分别取6个不同批次的骨疏宁口服液各一份，每份精密量取10 mL，按“2.2.3供试品制备”方法制备，精密吸取10 μL，进样按2.2.1项下色谱条件测定柚皮苷和淫羊藿苷峰面积并计算含量。结果见表3。

表3 6批样品测定结果

3 结 论

3.1 薄层色谱条件的选择

淫羊藿的TLC鉴别[6-7]，曾尝试以乙酸乙酯-丁酮-甲酸(10：1：1：1)溶液以及续断的展开剂三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)10 ℃冷藏过夜的下层溶液展开，但分离效果均不理想，最终以甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸(4：6：6：1：0.5)溶液展开，达到最佳分离效果。

续断的TLC鉴别[8-11]，同时考察了四种展开剂，分别是三氯甲烷-正丁醇-甲醇-水(2：3：1：3)下层溶液、正丁醇-醋酸-水(50：10：40)上层溶液、乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-水(40：15：22：10)10 ℃冷藏过夜的下层溶液、三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)10 ℃冷藏过夜的下层溶液，结果以三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)10 ℃冷藏过夜的下层溶液为展开剂分离效果最好。续断初步考察的提取方法与淫羊藿提取方法接近，确定展开剂后，尝试以淫羊藿鉴别项下供试液为续断鉴别供试液，结果两种提取方法的斑点分离效果和清晰度没有差异，最终确定续断与淫羊藿共用供试液，提取一次样品用不同展开剂展开可鉴别续断和淫羊藿两种成分。

骨碎补的TLC鉴别[11-12]，分别考察了乙酸乙酯提取以及水饱和的正丁醇提取两种方法，结果乙酸乙酯提取法的斑点分离效果好，水饱和的正丁醇提取未能分离斑点。展开剂三氯甲烷-丙酮-甲醇(5：1：1)溶液展开的比移值偏小，调整为4：1：1展开后，比移值适中，各成分斑点均能较好分离，但斑点不够清晰。改用聚酰胺薄膜代替硅胶G薄层板展开，各成分均能分离，斑点清晰，阴性对照无干扰。

丹参的药理活性成分主要分为两大类，即脂溶性成分及水溶性成分。脂溶性成分：丹参酮I、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮等；水溶性成分：丹酚酸A，B，C、丹参素及原儿茶醛等[13]。丹参的TLC鉴别，曾参照《中国药典》2015年版一部丹参鉴别项下丹参酮ⅡA成分的薄层鉴别方法，但供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，未见相同的暗红色斑点，可能受供试品的制备工艺影响，丹参酮ⅡA属于脂溶性成分，供试品提取工艺所用水煮的方法不能将其提取出来或能提取出来的量较少，故此法不可用。而参照《中国药典》2015年版一部丹参鉴别项下用丹酚酸B成分进行鉴别，但供试品部分斑点未完全分开，阴性有部分斑点干扰，不可用。参考含有丹参成分的其他中药处方中丹酚酸B的检出条件[14]，对提取溶剂乙酸乙酯、乙醚等溶剂进行考察，最终形成上述丹参的薄层色谱鉴别方法。由于点成点状样品和对照品展开后都严重拖尾，点成条状后可以解决。

3.2 HPLC提取条件选择

由于骨疏宁口服液含有19味药材，成分过于复杂，采用超声与回流等常规提取方法，提取液中杂质干扰较多，并且在柚皮苷峰处有干扰。因此采用聚酰胺进行净化处理，先用蒸馏水洗脱，除去杂质，再用95%乙醇洗脱[15]。制得的供试品溶液提取率高，且提取液中杂质干扰较少。

3.3 HPLC洗脱条件选择[16-18]

曾对乙腈-水、乙腈-0.5%冰醋酸溶液流动相进行了考察，最终以乙腈-0.5%冰醋酸溶液梯度洗脱达到的效果最佳，本方法同时测定了柚皮苷和淫羊藿苷的含量，缩短了检验的时间，并对该色谱方法进行了系统的方法学考察，建立了可行、简便、准确的含量测定方法。

目前院内制剂质量控制技术水平相对落后，大部分仅有定性鉴别方法，少数涉及含量测定，未能有效控制制剂产品的质量，因此提高院内制剂产品质量标准成为迫在眉睫的任务。本课题通过对骨疏宁口服液中淫羊藿、骨碎补、续断和丹参药材进行定性鉴别，HPLC法测定淫羊藿苷和柚皮苷两种黄酮类成分的含量，方法简便，分离效果好，专属性较强，为骨疏宁口服液多指标质量标准的建立提供科学依据。