FoxM1促进ABCA8表达参与骨肉瘤对顺铂化疗的耐药性

陈 静，鲁康洋，李明凤，尹 玉,2，曹立宇,3，蔡永萍,2

骨肉瘤是好发于青少年的原发性骨肿瘤，恶性程度高，尤其行新辅助化疗耐药的患者预后差[1-2]。因此，化疗耐药成为制约骨肉瘤治疗效果的瓶颈，探索化疗耐药机制及寻找逆转靶点是骨肉瘤患者治疗的一大难题。近年研究发现叉头蛋白转录因子1(Forkhead Box M1, FoxM1)在促进肿瘤的发生、发展及化疗耐药中扮演重要角色[3]。鲁康洋等[4]报道FoxM1在耐药骨肉瘤细胞中的表达明显升高，临床骨肉瘤组织中FoxM1表达高的患者生存率较低。Isakoff等[5]认为骨肉瘤对化疗耐药可能与多种因素有关，但其发生机制尚不清楚。三磷酸腺苷结合盒转运体(ATP binding cassette, ABC)是一种细胞膜转运蛋白，在多种肿瘤化疗耐药方面起重要作用[6]，ABCA8是ABC家族成员之一。有研究表明ABCA8的表达增高与肿瘤化疗耐药密切相关[7]。但FoxM1是否通过调控ABCA8参与骨肉瘤对化疗耐药，目前尚未见报道。本文着重探讨FoxM1是否通过增强ABCA8的表达促进骨肉瘤细胞对顺铂化疗的耐药，期望为临床逆转骨肉瘤化疗耐药提供新思路和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 试剂骨肉瘤细胞系MG63购自中科院上海细胞库。FoxM1抗体(克隆号ab175798)、β-actin抗体购于Abcam公司，ABCA8抗体(克隆号24351-1-AP)购自Proteintech公司。Thiostrepton(CAS：1393-48-2)购自Sigma公司；qRT-RCR试剂盒和Lipofectamine 2 000购自Invitrogen公司；ABCA8-shRNAs PLKO载体购自Sigma-Aldrich。顺铂购自南京制药公司。

1.2 细胞培养细胞在含10%灭活胎牛血清的DMEM培养液中培养，2～3天弃1次旧液，0.25%胰蛋白酶消化传代继续培养。课题组前期建立的顺铂耐药细胞系MG63/R在含2 μg/mL顺铂培养液中稳定生长和传代；前期建立的稳定过表达FoxM1及对照组细胞分别命名为MG63/LV-FoxM1和MG63/LV-NC。

1.3 shRNA敲低ABCA8瞬时慢病毒载体细胞shRNA靶序列构建到PLKO载体中，对构建的载体进行测序鉴定并转染293T细胞，荧光显微镜下观察转染率。收集上述病毒上清，转染细胞，经嘌呤毒素筛选建立ABCA8敲低细胞株。shRNA序列如下：ABCA8-sh1：5′-CCGGCATGGGTCATAGTATCTGATA CTCGAGTATCAGATACTATGACCCATGTTTTTTG-3′；ABCA8-sh2：5′-CCGGCCAAATTCTGTGTTCCTGTTTC TCGAGAAACAGGAACACAGAATTTGGTTTTTTG-3′；NTC：5′-CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCG AGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTT-3′。

1.4 qRT-PCR采用Trizol试剂提取总RNA。通过分光光度法测定RNA的纯度和浓度。逆转录PCR，具体操作步骤参考试剂盒说明书进行。FoxM1引物序列：上游5′-TGCAGCTAGGGATGTGAATCTT C-3′，下游5′-GGAGCCCAGTCCATCAGAACT-3′；ABCA8引物序列：上游5′-TGAAATGGAGCCGATCCT TC-3′，下游5′-AGTATTGCAGTGATTTGGCCTT-3′；18S引物序列：上游5′-CGGCGACGACCCATTCGA AC-3′，下游5′-GAATCGAACCCTGATTCCCCGTC-3′。本组以18S rRNA为内参。

1.5 Western blot法收集细胞后加入裂解液，提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后5%脱脂牛奶封闭1 h以上，再加入一抗FoxM1(1 ∶1 000稀释)、ABCA8(1 ∶1 000稀释)或β-actin(1 ∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的兔二抗(1 ∶10 000稀释)室温孵育2 h，显影。

1.6 染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)直径10 cm平皿培养的骨肉瘤耐药细胞MG63/R中加入1%甲醛，37 ℃交联固定DNA与蛋白质10 mim。用冷PBS洗涤细胞，并用细胞裂解法收集细胞，超声处理10 min后，离心取上清。4 ℃孵育3 h，加入IgG beads，旋转仪4 ℃过夜。对复合物清洗，纯化的DNA片段通过qRT-PCR分析。加入FoxM1抗体为实验组，不加抗体为阴性对照(CTR)。具体步骤参考EZ-ChIP试剂盒(Millipore)。运用生物信息学法在Ensemble：http://www.ensembl.org/indexhtml网站查找ABCA8基因上游2 000 bp的启动子区域。用Jaspar http://jaspar.genereg.net/预测FoxM1在ABCA8基因上游启动子区域(forkhead response elements, FHRE)的结合位点。引物序列叉头反应元件如下：5′-AGA TCTTTTCTTCTAGGGGTCTGAC-3′和5′-GAGGAGTA AGAGGCTCAACATGGT-3′；5′-TTTCACAGCGGCTGC ACTAA-3′和5′-AGCAGCATGAGAGCAGACTAATA CA-3′。

1.7 细胞增殖实验将处于对数生长期的骨肉瘤贴壁细胞以每毫升2×104个细胞分别接种于96孔板，培养24 h后弃去培养液，分别加入DMSO、联合使用4 μmol/L Thiostrepton或单独使用2 μg/mL顺铂。第1～5天，每孔中加入新鲜配置的MTT溶液，37 ℃保存4 h后弃去液体，每孔加入150 μL DMSO，紫色结晶溶解，室温摇床摇10 min，490 nm处测定吸光度。

2 结果

2.1 骨肉瘤耐药细胞中FoxM1和ABCA8的表达课题组前期已获得的骨肉瘤亲本细胞和耐药细胞中分别采用qRT-PCR法和Western blot法检测FoxM1和ABCA8 mRNA和蛋白的表达。qRT-PCR法检测结果显示：骨肉瘤耐药细胞中FoxM1和ABCA8的mRNA表达比亲本细胞明显升高(图1A)。Western blot检测结果显示：耐药细胞MG63/R的蛋白表达高于亲本细胞MG63，以上数据表明FoxM1和ABCA8蛋白表达在耐药细胞中比亲本细胞明显增高(图1B)。

图1 A.qRT-RCP法检测MG63/R和MG63细胞中FoxM1和ABCA8 mRNA的表达，*P<0.05；B.Western blot法检测MG63/R和MG63细胞中FoxM1和ABCA8蛋白的表达

2.2 FoxM1与ABCA8的相关性qRT-PCR结果显示，过表达FoxM1 MG63/LV-FoxM1中FoxM1与ABCA8的mRNA表达水平与对照组相比，其表达量明显升高(图2A)。Western blot检测显示，与对照组MG63/LV-NC相比，MG63/LV-FoxM1的FoxM1与ABCA8蛋白表达明显升高(图2B)。

图2 A.qRT-PCR法检测FoxM1过表达MG63/LV-FoxM1及对照组MG63/LV-NC中FoxM1及ABCA8 mRNA的表达，*P<0.05；B.Western blot法检测MG63/LV-FoxM1和MG63/LV-NC细胞中FoxM1及ABCA8蛋白的表达

2.3 FoxM1抑制剂Thiostrepton与ABCA8表达的关系在耐药细胞MG63/R中加入4 μmol/L Thiostrepton，处理24 h后检测FoxM1及ABCA8的mRNA表达，48 h后检测其蛋白表达。qRT-PCR结果显示，4 μmol/L Thiostrepton处理后的骨肉瘤耐药细胞FoxM1及ABCA8 mRNA表达明显下降(图3A)。Western blot结果显示，4 μmol/L Thiostrepton处理组与DMSO组FoxM1与ABCA8蛋白表达相比，其表达量明显下降(图3B)。

图3 A.qRT-PCR检测FoxM1及ABCA8 mRNA的表达，*P<0.05；B.Western blot法检测ABCA8及FoxM1蛋白的表达

2.4 抑制FoxM1或ABCA8对骨肉瘤细胞顺铂化疗的影响在骨肉瘤耐药细胞MG63/R和FoxM1过表达细胞株MG63/LV-FoxM1中分别加入2 μg/mL顺铂+DMSO或2 μg/mL顺铂+4 μmol/L Thiostrepton，结果显示：与DMSO组相比，Thiostrepton处理后，细胞增殖能力明显降低(图4A、B)。在MG63/R和MG63/LV-FoxM1中分别用shRNA敲低ABCA8，结果显示，同NTC组相比，ABCA8 shRNA敲低组骨肉瘤细胞的增殖能力亦明显降低(图4C、D)。

图4 细胞增殖实验显示，MG63/R(A)和MG63/LV-FoxM1(B)中分别给予2 μg/mL顺铂+DMSO或2 μg/mL顺铂+4 μmol/L Thiostrepton，与DMSO组相比，联合Thiostrepton处理后，细胞增殖能力明显降低；在MG63/R(C)和MG63/LV-FoxM1(D)中分别给予2 μg/mL顺铂或shRNA敲低ABCA8，与NTC组相比，骨肉瘤细胞的增殖能力亦明显降低

2.5 ChIP实验检测FoxM1与ABCA8启动子结合运用生物信息学预测ABCA8基因上游启动子区域FHRE位点是-1 383～-1 373区域，具体作用序列是TCTTTTTTATA(图5A)。ChIP结果显示：与对照组相比，FoxM1在ABCA8启动子区域富集(图5B)。以上实验结果表明FoxM1可能与ABCA8启动子区域结合并促进ABCA8转录。

图5 A.运用生物信息学预测ABCA8基因上游启动子区域FHRE位点；B.与CTR相比，FoxM1在ABCA8启动子区域FHRE富集，表明FoxM1可能与ABCA8启动子区域直接结合促进ABCA8转录

3 讨论

骨肉瘤是一种间叶组织来源常见的骨原发性高度恶性肿瘤，好发于青少年。目前，骨肉瘤治疗采用术前新辅助化疗和手术切除及术后辅助化疗的综合治疗,标准化疗方案包括甲氨喋呤、阿霉素和顺铂[1]。然而患者的生存率并未得到有效提高，新辅助化疗耐药的患者易出现复发和远处转移，治疗困难，即使联合其它药物治疗也未能明显改善患者预后[8]。因此，探索化疗耐药机制成为骨肉瘤亟需解决的难题。

研究认为骨肉瘤对化疗耐药可能与多种因素有关[2,5]，如ABC转运体表达增高促进药物外排能力增强、谷胱甘肽/谷胱甘肽S转移酶改变药物代谢对化疗药物的灭活、DNA拓扑异构酶改变导致抗肿瘤靶点改变等。目前，骨肉瘤化疗耐药的发生机制仍不清楚。近年研究发现FoxM1广泛表达于多种肿瘤组织中，且与肿瘤的发生发展、血管形成、转移和化疗耐药密切相关[3,9]。我们前期实验也做了一些相关分析，如发现骨肉瘤细胞中FoxM1通过上调DNA损伤修复蛋白Rad50和Rad51表达，促进骨肉瘤细胞的化疗耐药[4,10]。但FoxM1促进化疗耐药的分子机制仍然未知，尤其FoxM1与ABC转运体在骨肉瘤化疗耐药中的相关报道非常有限。

ABC转运体属于细胞膜转运蛋白，通过细胞膜泵药物外排或促进肿瘤干细胞表达参与化疗耐药[6,11-12]。ABC转运体家族蛋白表达增高与骨肉瘤化疗耐药相关，患者预后更差[13]。近年研究显示FoxM1可能调控ABC转运体，如在结直肠癌中FoxM1上调ABCC10参与对5-氟脲嘧啶的耐药[14]。ABCA8是ABC转运蛋白家族的成员之一[15]，在卵巢癌中ABCA8的表达增高与化疗耐药及预后差密切相关[7,16]。但FoxM1是否调控ABCA8，目前尚未见报道。本组发现在耐药细胞MG63/R中FoxM1和ABCA8的表达均比亲本细胞MG63明显升高，抑制FoxM1后ABCA8的mRNA和蛋白表达量也明显下降，而过表达FoxM1后ABCA8的表达也同时上升。此外，联合使用FoxM1抑制剂或降低ABCA8的表达可增强骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性。因此，作者推测FoxM1可能通过调控ABCA8参与骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性。研究发现FoxM1通过影响细胞凋亡参与化疗耐药[3]，本组将在后续实验中进一步采用流式细胞术等方法探讨FoxM1及ABCA8是否影响细胞凋亡。

本组为了分析FoxM1和ABCA8的具体作用机制，进行了ChIP检测。ChIP是一种研究蛋白质与DNA直接相互作用的方法，并被广泛应用于转录因子与靶基因启动子区特异核苷酸序列结合方面的研究[17]。本组通过生物信息学法预测和ChIP技术发现FoxM1在ABCA8启动子中的结合位点是-1 383至-1 373区域中的FHRE区域富集，具体作用序列是TCTTTTTTATA，表明FoxM1可能通过与启动子区域结合促进ABCA8转录，但后续可能需要双荧光素酶报告基因法进一步验证FoxM1正向调控ABCA8的表达。实验推测FoxM1可能通过调控ABCA8参与骨肉瘤细胞化疗耐药，还需积累更多的体内外实验，进一步验证联合FoxM1抑制剂或抑制ABCA8是否增加顺铂化疗药物的敏感性。此外，也有研究报道通过ChIP技术发现FoxM1与ABCC5启动子区域结合，促进其转录参与鼻咽癌细胞对紫杉醇化疗耐药[18]。

肿瘤细胞对化疗的耐药性是导致骨肉瘤患者化疗失败的重要原因，分析化疗耐药机制及寻找逆转靶点是现阶段骨肉瘤治疗的难题。本组发现FoxM1可能通过调控ABCA8参与骨肉瘤对顺铂的耐药，抑制FoxM1或ABCA8的表达可能成为临床逆转骨肉瘤对顺铂化疗耐药的新靶点。