GTPBP4基因对结肠癌HCT116细胞生物学行为及裸鼠成瘤能力的影响及机制

唐 丹，段 怡，周晓青，杨志惠

2018年全球癌症调查数据显示，结直肠癌(colorectal cancer, CRC)发病率位居恶性肿瘤的第3位，病死率已跃居第2位[1-2]。CRC治疗通常以化疗为主，但化疗毒性高，机体反应相对较低。因此，研发并探寻新的治疗途径尤为关键[3]。分子靶向治疗是干预肿瘤细胞内信号传导通路中一些关键分子，阻断信号通路的传导，起到抑制肿瘤细胞生长的作用，并且对周围正常细胞毒副作用较小。在发挥抗肿瘤作用方面，由于分子靶向药物的快速发展和临床应用，肿瘤的系统性治疗已经取得重大进展[4]。CRC的特征是具有遗传多样性，因此从CRC发病机制的不同角度探寻新的分子靶点尤为关键。GTP结合蛋白4(GTP binding protein 4, GTPBP4)基因，即核仁G蛋白(nucleolar G protein, Nog1)、脑红蛋白(neuroglobin, NGB)、慢性肾功能衰竭基因(chronic renal failure gene-1, CRFG)。GTPBP4基因定位于染色体10p14-p15，编码的GTPBP4蛋白广泛表达于从锥虫到人类的真核生物细胞核，是核仁中重要的功能蛋白[5]。在本课题前期的体外实验中发现，沉默GTPBP4基因后，结肠癌细胞株RKO[6]及HT29[7]发生G0/G1期阻滞，细胞凋亡率增加，细胞增殖受抑。原癌基因c-Jun属于Jun家族，是激活蛋白-1(activating protein-1, AP-1)的重要组成部分[8]，并且其与众多肿瘤关系密切。有研究表明，由LMP1诱导的c-Jun/Jun B异二聚体可以上调Cyclin D1启动子的活性和表达，Cyclin D1的过表达加速了细胞周期的进展。结合前期的实验结果，以及通过进一步实验来验证沉默GTPBP4基因对结肠癌细胞裸鼠成瘤能力的影响，并探究其与原癌基因c-Jun之间的联系。

1 材料与方法

1.1 主要材料人结肠癌HCT116细胞株购自中国科学院上海细胞库；shRNA慢病毒载体购自上海吉凯基因化学公司；细胞周期、细胞凋亡试剂盒购自BD公司；CCK-8试剂购自碧云天公司；4～6周龄体重16～18g BALB/c裸鼠购自成都达硕实验动物公司，许可证号SCXK(川)2015-030；兔抗人GTPBP4单克隆抗体、兔抗人Cyclin D1单克隆抗体购自Abcam公司；鼠抗人BCL-2单克隆抗体、鼠抗人Bax单克隆抗体、c-Jun兔抗人单克隆抗体购自CST公司；倒置显微镜购自Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1稳定低表达GTPBP4细胞株筛选 消化对数生长期的HCT116细胞并以每毫升5×104个的细胞密度接种于6孔板中；对6孔板细胞进行慢病毒感染(MOI=20)；感染72～96 h后，倒置荧光显微镜下观察荧光表达。确定细胞表达绿色荧光后，将细胞培养基更换为含有2 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基，每3天更换1次含嘌呤霉素的培养基，筛选维持3周左右。qRT-PCR及Western blot实验检测稳定细胞株GTPBP4基因沉默效率。

1.2.2平板克隆形成实验 取处于对数生长期的各组细胞，以每孔200个细胞数接种于6孔板中，每组种板设3个复孔。于37 ℃ 5%CO2恒温培养箱培养2～3周。培养皿中生长出肉眼可见的细胞集落时，终止细胞培养，以4%多聚甲醛溶液固定6孔板中的细胞15～30 min。500 μL结晶紫溶液，室温下染色15 min，洗去多余染色液，干燥后计数拍照。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.2.3裸鼠皮下结肠癌移植瘤模型建立 将10只裸鼠随机分为两组后编号，饲养于SPF级动物房。胰酶消化收集对数生长期阴性对照组及实验组细胞，调整细胞密度为每毫升1×107个，消毒裸鼠右侧腋背部皮肤，按每只裸鼠0.2 mL体积接种，沿皮下斜行进针，注射完毕后可见直径0.5～0.8 cm皮丘形成，表示接种成功。当接种部位形成肉眼可见瘤结节时，每间隔3天用游标卡尺测量瘤体最长径(a)及与之垂直的短径(b)，最终瘤体体积按照公式V=1/2ab2计算。记录并分析数据。接种4周后采用脱颈椎法处死裸鼠，剥离皮下瘤结节，拍照后称量瘤重。瘤组织用10%中性福尔马林固定，以便行常规HE及免疫组化染色。

1.2.4Western blot法 RIPA裂解细胞提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液后沸水中煮沸5～10 min使蛋白变性。配置10%分离胶及5%浓缩胶，浓缩胶恒压80 V跑胶30 min，分离胶恒压110 V跑胶90 min。切下相应分子量的胶，以200 mA恒流4 ℃电转30～90 min。5%牛奶封闭液室温封闭1 h。4 ℃一抗孵育过夜。次日TBST洗净多余一抗后，二抗室温孵育1 h。滴加ECL试剂，于成像仪中曝光成像。Image J软件分析各条带灰度值。

1.2.5免疫组化 实验采用免疫组化EnVision法检测蛋白表达。4～6 μm厚石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；按照各抗体说明书选择柠檬酸盐缓冲液或EDTA进行抗原热修复；1 ∶100～1 ∶200稀释一抗，滴加于组织上，室温孵育4 h；即用型二抗均匀滴加于组织上，室温孵育30 min；DAB显色，苏木精复染细胞核。乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

2 结果

2.1 HCT116稳定细胞株沉默效率将嘌呤霉素筛选3周后的实验组(shGTPBP4)、阴性对照组(shControl)的两组细胞置于倒置荧光显微镜下观察，见两组细胞均完全表达GFP绿色荧光蛋白。进一步检测细胞GTPBP4 mRNA相对表达量及蛋白表达，实验组GTPBP4 mRNA相对表达量为0.074 2±0.004 4，阴性对照组GTPBP4 mRNA相对表达量为1.003 2±0.099 9，实验组的表达量明显低于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.01，图1)。实验组稳定细胞株GTPBP4蛋白的表达明显低于阴性对照组。由两组相对mRNA表达量计算得出实验组GTPBP4基因沉默效率为92.60%。

图1 HCT116稳定细胞株沉默效率检测：A.qRT-PCR法检测两组细胞mRNA相对表达量，**P<0.01；B.Western blot法检测两组细胞GTPBP4蛋白表达

2.2 细胞增殖活性检测将两组稳定转染细胞株接种于96孔板中检测不同时间点450 nm处OD值，接种24、48、72、96 h的阴性对照组OD值分别为0.764 1±0.021 9、1.470 1±0.148 4、2.221 5±0.146 9、3.127 4±0.020 6，实验组OD值分别为0.536 6±0.029 8、0.899 9±0.023 3、1.152 7±0.050 8、1.687 8±0.341 0，各时间点实验组OD值均低于阴性对照组，差异有统计学意义(P均<0.001，表1，图2)。并由此可计算实验组24、48、72、96 h的细胞增殖平均抑制率分别为29.77%、38.79%、48.11%、46.03%。

表1 两组不同时间点的OD值

图2 CCK-8法检测两组细胞各时间点的增殖曲线

2.3 沉默GTPBP4基因对HCT116细胞克隆形成能力的影响在细胞平板集落形成实验中，阴性对照组细胞集落形成数目为(127.00±12.49)个，克隆形成率为63.5%；实验组细胞集落数目为(15.33±5.51)个，克隆形成率为7.67%，两组相比，实验组克隆形成率明显降低，两组相比差异有统计学意义(P<0.01，图3)。

图3 阴性对照组及实验组细胞集落形成

2.4 沉默GTPBP4基因对HCT116细胞裸鼠成瘤能力的影响

2.4.1裸鼠移植瘤瘤体体积生长曲线 接种6天后可见皮下结节形成，随着结节的增长，两组裸鼠平均体重减少，消瘦明显，阴性对照组瘤结节最大者于第23天死亡，剩余4只；实验组裸鼠消瘦明显，5只全部存活。每间隔3天测量记录并计算瘤体体积，绘制生长曲线(图4)，结果显示，于第6天至第26天合计6次测量两组瘤体体积，自测量第10天起实验组皮下瘤体体积均较阴性对照组小，两组相比差异有显著性(P均<0.05)，且随着时间的增长，实验组瘤体积较阴性对照组减小更为明显。

图4 阴性对照组及实验组细胞裸鼠瘤体体积生长曲线

2.4.2裸鼠移植瘤瘤体质量 接种细胞后的第28天用脱颈椎法处死裸鼠，剥离皮下瘤结节，微量电子称进行瘤体称重，实验组平均瘤体质量为(0.094 2±0.044 5)g，阴性对照组平均瘤体质量为(0.694 0±0.149 5)g，实验组瘤体质量明显小于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.01，图5)。此结果表明沉默GTPBP4基因能显著抑制HCT116细胞裸鼠皮下成瘤能力。

图5 两组细胞裸鼠皮下移植瘤对比：A.阴性对照组及实验组移植瘤剥离前对比；B.两组移植瘤剥离后对比

2.5 Western blot法检测细胞及裸鼠瘤体组织中蛋白的表达Western blot法检测阴性对照组及实验组稳定转染细胞株及裸鼠移植瘤瘤体各蛋白表达情况，实验组细胞及瘤体组织中的GTPBP4蛋白表达均明显降低，说明在裸鼠成瘤过程中HCT116细胞稳定低表达GTPBP4基因，在此基础上细胞及瘤体组织中c-Jun、Cyclin D1、BCL-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高(图6)。

图6 Western blot法检测两组细胞及瘤体组织中GTPBP4、c-Jun、Cyclin D1、BCL-2和Bax蛋白表达水平：A.细胞及组织各蛋白条带图；B.各蛋白灰度值分析柱形图，**P<0.01

2.6 免疫表型瘤体组织免疫组化结果显示，GTPBP4、c-Jun、Ki-67及Cyclin D1表达均定位于细胞核，BCL-2、Bax表达定位于细胞膜及细胞质(图7)。阴性对照组GTPBP4、c-Jun、BCL-2、Ki-67及Cyclin D1染色呈棕黄色颗粒，且分布广泛，呈弥漫强阳性；实验组瘤体GTPBP4、c-Jun、BCL-2、Ki-67及Cyclin D1染色均较浅，呈散在弱阳性，表达明显较阴性对照组低；而Bax表达在阴性对照组中较实验组弱。免疫组化染色结果与Western blot检测结果一致。Ki-67主要反映肿瘤细胞的增殖活性，Ki-67在阴性对照组中的表达较强，间接表明阴性对照组细胞的增殖能力较强。

图7 瘤体组织中各蛋白的表达：GTPBP4、c-Jun表达定位于细胞核，BCL-2、Bax表达定位于细胞膜及细胞质，EnVision法

3 讨论

从GTPBP4基因在肿瘤中的研究现状来看，Liu等[9]发现敲低GTPBP4基因在肝癌中的表达，能降低肝癌细胞增殖能力及裸鼠成瘤能力，这与本课题在结肠癌细胞株中的研究结果相符，进一步通过对基因芯片和通路富集分析，有学者认为ERBB信号通路可能是该基因重点作用的通路之一。在胃癌中的研究表明，GTPBP4基因在癌组织中表达高于癌旁组织，GTPBP4的稳定敲除抑制了细胞的增殖，促进细胞凋亡；从机制上讲，GTPBP4与p53的相互作用使p53及其相关信号通路在GTPBP4稳定敲减情况下被激活[10]。此外，高表达GTPBP4的结肠癌患者预后较差，GTPBP4通过抑制RhoA的活性，特异性地诱导丝状肌动蛋白重排，促进晚期结肠癌的侵袭、转移[11]。

本组实验结果发现，沉默GTPBP4基因后，结肠癌HCT116细胞增殖能力明显受到抑制，体内外成瘤能力明显减弱。肿瘤Ki-67增殖指数在裸鼠移植瘤中的表达也明显降低。进一步研究发现GTPBP4表达下调后，原癌基因c-Jun在结肠癌细胞株中的蛋白水平表达随之下调，并且在裸鼠移植瘤中检测到的c-Jun蛋白表达也有所降低。由此推测GTPBP4基因与c-Jun基因在结肠癌的发生、进展过程中存在某种联系。

AP-1是由Fos、Atf、Jun和MAF家族亚单位蛋白组成的二聚体转录因子，作为致癌转化的介质因子[12]，AP-1参与包括炎症、分化、细胞迁移、肿瘤转移、血管生成和伤口愈合在内的一系列生物学过程[13]。Jun家族蛋白成员包括c-Jun、Jun B和Jun D，c-Jun由核内原癌基因c-Jun编码，具有正向调节细胞增殖的作用[14]。实验中GTPBP4表达下调后，c-Jun蛋白及Cyclin D1的表达同时下调，可能是由于c-Jun作为上游调控基因，通过抑制p53肿瘤抑制剂和促进细胞Cyclin D1表达调节增殖进程[15]。这在一定程度上可以解释GTPBP4下调后引起Cyclin D1表达降低的原因。

在调控凋亡发生方面，有研究报道BCL-2与c-Jun、c-Fos在胃癌中的表达呈正相关，并且晚期癌症中的表达水平更高，三者共同作用介导胃癌的发展[16]。c-Jun是c-Jun N末端激酶(JNK)的下游靶效应分子，β-半乳糖苷结合蛋白(gal-1)通过JNK/c-Jun/AP-1途径对T细胞死亡起一定的调控作用[17]。c-Jun N末端激酶JNK1/2/3-、p38-和ERK1/2-MAPK/c-Jun级联信号通路可能有助于上调胃癌细胞中BARF1诱导的抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-xL的表达，这有利于胃癌的发展[18]。Schwarz等[19]的研究中发现抗凋亡蛋白BCL-2 ERK途径以时间和浓度依赖性方式导致c-Jun在SER73位点磷酸化，以促进更好发挥抑制细胞凋亡的作用。

总之，本实验探讨了下调GTPBP4基因的表达对结肠癌细胞体内及体外细胞增殖能力的影响。结果表明GTPBP4基因在结肠癌中主要是发挥癌基因的功能，促进结肠癌细胞增殖与发展。可能是通过调控c-Jun、Cyclin D1、BCL-2/Bax的表达，发挥促进肿瘤细胞增殖的作用。本实验证实了GTPBP4基因在结肠癌发生、发展中的作用，为该基因成为分子治疗靶标提供了实验依据。