水动力尾静脉注射介导Akt/β-catenin/Yap质粒转染建立小鼠肝癌模型

蒋雨薇，宋海燕,2，李怡萍，汤凯悦，徐娇雅，SULAIMAN Andrew，MCGARRY Sarah，WANG Lisheng，郑培永,2

原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤，流行病学统计显示我国肝癌发病率及病死率均较高，发病率位居恶性肿瘤的第3位[1]。肝癌具有恶性程度高、病情进展迅速等特点。目前仍然缺乏有效的治疗药物，大部分患者预后差[2]。建立恰当的动物模型是研究肝癌治疗方法的基础和前提[3]。水动力尾静脉注射(hydrodynamic tail vein injection, HTVi)联合Sleeping Beauty(SB)质粒转座子可介导一种或几种促癌基因整合到肝细胞中，肝细胞稳定表达促癌基因从而形成肝癌。既往研究显示蛋白激酶B(protein Kinase B, PKB)或Akt、β-catenin、转录共激活因子相关蛋白(yes-associated protein, Yap)在肝癌组织中表达显著增加，是肝癌促癌基因[4-6]。本文通过给予C57BL/6J小鼠尾静脉水动力高压注射SB质粒及Akt/β-catenin/Yap促癌基因质粒的方法构建肝癌动物模型，为肝癌研究提供了新的有价值的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物C57BL/6J小鼠，SPF级，6周龄，雄性，共10只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK(沪)2007-0005。小鼠饲养于室温(22±3)℃、相对湿度50%～70%的环境中。动物实验步骤由上海中医药大学附属龙华医院动物实验伦理委员会批准，实验操作遵循实验动物饲养和使用指南。

1.2 试剂与药物LB培养基预混粉末、LB肉汤琼脂培养基预混粉末购于碧云天生物公司。DH-5α感受肽菌购于天根生化公司。质粒大量抽提试剂盒为Promega产品。质粒PT2/C-Luc/PGK-SB13、pT3-myr-AKT-HA、pT3-EF1aH N90-β-catenin、pT-3EF1a-Yap S127A均从Addgene公司获得，其中PT2/C-Luc/PGK-SB13由John Ohlfest赠予(Addgene plasmid #20207；http://n2t.net/addgene:20207；RRID：Addgene_20207)[7]，pT3-myr-AKT-HA由Xin Chen赠予(Addgene plasmid #31789；http://n2t.net/addgene:31789；RRID：Addgene_31789)[8]，pT3-EF1aH N90-β-catenin由Xin Chen赠予(Addgene plasmid # 86499；http://n2t.net/addgene:86499；RRID: Addgene_86499)[9]，pT-3EF1a-Yap S127A由Xin Chen赠予(Addgene plasmid#46049；http://n2t.net/addgene:46049；RRID: Addgene_46049)[10]。Akt、β-catenin、Yap、二抗(抗兔)抗体购于Cell Signaling公司。PVDF膜(0.22、0.45 μm)、ECL化学发光底物购于Millipore公司。RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购于碧云天生物公司。10%丙烯酰胺购于BIO-RAD公司。丽春红染色试剂购于康为世纪公司。苏木精染色剂、中性树胶购于上海亿欣生物公司。

1.3 实验方法

1.3.1质粒扩增抽提 将含有PT2/C-Luc/PGK-SB13、pT3-myr-AKT-HA、pT3-EF1aH N90-β-catenin、pT-3EF1a-Yap S127A质粒导入DH-5α感受态细胞进行扩增，在LB培养基上生长后挑选适合的菌落放到大肠杆菌培养液中，在震荡培养箱培养繁殖，使用Promega质粒大提试剂盒抽提纯化，检测浓度备用。

1.3.2小鼠HTVi质粒造模 尾静脉高压注射方法参照文献[11]所述，将质粒混合于2 mL PBS中配置成溶液，在10 s内通过尾静脉注射的方式注射至小鼠体内。10只小鼠适应性饲养，随机分为对照组(n=5)，模型组(n=5)。模型组尾静脉快速注射含有15 μg PT-3EF1a-Yap S127A、15 μg pT3-EF1aH N90-β-catenin、15 μg pT3-myr-AKT-HA和5 μg PT2/C-Luc/PGK-SB13的质粒混合溶液2 mL，对照组给予等量PBS。8周后小鼠麻醉处死，取肝脏组织冻存或多聚甲醛固定备用。

1.3.3小鼠活动、体重、肝重与肝体比 观察记录小鼠活动情况，测量体重、肝重，计算肝体比。

1.3.4病理学检查 观察小鼠肝脏形态。肝组织用4%多聚甲醛固定，进行脱水和石蜡包埋、切片、HE染色，镜下观察小鼠肝组织病理学变化。

1.3.5Western blot法 肝组织用RIPA裂解液匀浆提取蛋白，以12 000 r/min离心后收集上清液。细胞裂解物在10%丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭1 h，分别孵育Akt、Yap、β-catenin抗体4 ℃过夜，将膜在TBST溶液洗涤3次后室温孵育二抗，将膜洗涤3次并通过ECL发光底物曝光显影，将PVDF膜上全蛋白以丽春红染色作为上样量参照。

2 结果

2.1 小鼠体重、肝重与肝体比变化实验期间对照组小鼠活动度好，饮食正常，皮毛光亮；尾静脉注射4周后，模型组小鼠出现活动度差，精神萎靡，活动减少，皮毛颜色发黄杂乱，并逐渐加重。1只模型组小鼠在实验第55天死亡。与对照组小鼠比较，模型组小鼠体重下降，肝重和肝体比显著增加(图1)。

图1 各组小鼠体重(A)、肝重(B)、肝体比(C)变化与对照组相比，*P<0.05

2.2 小鼠肝脏形态学变化对照组小鼠肝脏表面光滑，形态正常。模型组小鼠肝脏体积明显增大，质地较硬，肝脏表面出现大量颗粒状、结节样改变(图2)。

AB

镜下观察对照组肝小叶结构完整，轮廓清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶肝细胞分界清晰。模型组肝索排列紊乱，出现肿瘤结节，伴随肝细胞脂肪变性，炎细胞浸润(图3)。

100×400×对照组模型组

2.3 Western blot法检测小鼠肝组织中Akt、Yap、β-catenin蛋白表达水平实验以丽春红染色(ponceau S)总蛋白灰度作为上样量参照，结果显示，模型组与对照组相比，Akt、Yap、β-catenin蛋白表达均显著上调(图4)，提示转染的促癌基因在模型小鼠体内成功过表达。

图4 小鼠肝组织中Akt、β-catenin、Yap蛋白的表达：A.Western blot条带：1、3、5为对照组；2、4、6为模型组；B.蛋白表达相对值，与对照组相比，*P<0.05

3 讨论

目前几种常见的肝癌动物模型包括：诱导型模型通过亚硝胺类、黄曲霉素B1等化学药物诱导建立肝癌模型[12]，此类动物模型成功率高，但存在造模时间长达1年、造模病死率高等缺点。移植模型是将人源或动物源的肝癌细胞株或者肿瘤组织块种植到动物体内，包括皮下移植瘤模型、原位移植瘤模型[13-14]，目前应用较广。皮下瘤易于观察但不能模拟临床肿瘤生长的环境，原位种植瘤可一定程度反映肿瘤与微环境的作用及观察转移，但种植过程繁琐、技术要求高，另外种植模型多采用免疫缺陷鼠，不适合设计免疫系统的研究。转基因肝癌模型是通过基因工程的方法将特定的促癌基因导入/抑癌基因敲除，如建立肝炎病毒转基因模型、转化生长因子β激活激酶1基因敲除模型，能够模拟临床肿瘤发展的过程。但生殖细胞基因修饰的小鼠成本高、耗时长，需要较高专业水平，胚胎病死率高，且比较适用于特定基因对于肿瘤的影响，如要研究多个基因对肝癌的作用需要非常复杂的小鼠杂交完成[15-16]。

本组实验应用的肝癌造模方法需要三种要素：HTVi促进质粒转染、SB转座子介导基因整合、两侧带有反向重复序列及启动子的癌基因质粒。

HTVi是将大体积的质粒DNA溶液通过尾静脉快速注射到小鼠体内，高压情况下肝内皮细胞窗孔增大、肝细胞膜产生孔隙，特定的质粒DNA就能够通过孔隙进入肝细胞中[17]；也有研究认为大体积质粒DNA溶液经尾静脉快速注射会使小鼠出现短暂心衰，溶液经下腔静脉返流进入肝脏的同时血液在肝血窦中无法回流，质粒在肝脏中长时间停留最终被肝脏摄取[18]，10%～40%肝细胞可被转染。该技术可造成暂时性肝损伤，一般在1周内恢复正常。转染入细胞的DNA在8～24 h后开始迅速降解，SB转座子可将目的基因通过剪切插入整合至宿主基因，从而可稳定表达癌基因。该技术可达到2%～10%肝细胞长期稳定表达癌基因，最终诱导肝癌生成。根据转染癌基因的种类和个数不同，一般可在1周至数月形成肝癌。

Akt、β-catenin、Yap是肝癌发生、发展的重要相关信号通路的关键基因。Akt作为一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，其磷酸化即活化形式能够促进细胞增殖、迁移、分化、凋亡等过程[19]。在癌症的发生、发展过程中，β-catenin活化入核能够促进细胞的转移和增殖的靶基因的转录表达[20]。近几年研究发现Yap通过促进肝癌细胞增殖、侵袭和转移等恶性作用，成为肝癌形成的一条重要传导通路[21]。Akt、β-catenin、Yap三种基因能够通过不同信号通路，互相影响、调控，促进肝癌的形成。

本组实验采取尾静脉高压注射SB质粒及Akt/β-catenin/Yap质粒的方法进行肝癌造模。8周后病理检查结果显示，模型组肝脏增大出现肿瘤结节，表明模型组均形成肝癌。肝癌形成导致小鼠体重下降、精神和活动差，并导致实验结束前有1只小鼠死亡。模型鼠肝组织Akt、β-catenin、Yap基因出现显著高表达，提示这些癌基因导致肝细胞的癌变及增殖形成肝癌。既往有研究应用该技术通过转染Akt需要28周形成肝癌，Akt/Yap联合转染约6周[22]，而Akt/β-catenin联合转染约需4周[23]。本组应用Akt/β-catenin/Yap三种促癌基因诱导，以保障模型成功率，在8周时观察到肝癌已达严重程度并导致1只小鼠死亡，说明肝癌诱导成功的时间点较早，但具体时间需要后续动态观察实验再明确。国外多采用FVB/N小鼠运用该技术造模，但这种小鼠在国内饲养较少且价格较高，本组采用常规价廉的C57BL/6J小鼠，证实应用HTVi SB和癌基因质粒建立肝癌模型在C57BL/6J小鼠也较容易实现。

尾静脉高压注射质粒建立肝癌模型具有明显的优势：注射的特定癌基因相关质粒能够在肝脏中高效表达，可占正常肝细胞的2%～10%；注射通常在6～8周龄的小鼠中进行，不会对小鼠的胚胎发育产生任何影响，相比于转基因或基因敲除小鼠更加经济，且可显著减少实验所需的小鼠数量；尾静脉高压注射能够应用于不同遗传背景的小鼠，尤其是可用于非免疫缺陷小鼠，能够应用于信号通路、细胞表型及评估药物反应性等多种研究[24]。这项技术也存在一定不足：通过水动力转染成瘤的肝脏病变面积相对于一般人肝肿瘤来说太大，小鼠肝脏出现大量结节无法计数；大多数人肝癌组织有肝纤维化或肝硬化的背景，而水动力注射只是将特定的基因传递到正常肝脏中，缺少肿瘤进展的相关环境。若需要研究特定致癌基因在肿瘤进展中的作用，可考虑运用联合造模的方式，如在应用四氯化碳或高脂高糖饮食诱导的基础上进行质粒注射转染[25]。

综上所述，本实验利用HTVi SB质粒及Akt/β-catenin/Yap癌基因质粒的方法成功建立了小鼠肝癌模型，该模型对于研究促癌/抑癌基因单独或联合在肝癌发生中的作用尤其适用，因适用于非免疫缺陷型动物所以可应用于免疫、炎症等相关的肝癌发生、发展机制和治疗研究，另外将来可进一步联合其它动物造模方法研究基础疾病诱导的肝癌模型，如脂肪肝/代谢-肝癌、肝硬化-肝癌等。该方法经济便捷、病死率低、成功率高且发病机制与临床疾病相符，是一种可供今后科研和临床药物研究使用的肝癌动物模型。