柱前衍生化HPLC法测定麻黄粗多糖中4种单糖的含量*

林晓婷，王秋红，匡海学

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150000；2.广东药科大学，广东 广州510405）

麻黄为麻黄科植物草麻黄（Ephedra sinicaStapf）、中麻黄（Ephedra intermediaSchrenk et C.A.Mey.）或木贼麻黄（Ephedra equisetinaBge.）的干燥草质茎，为《中国药典》2020版一部收载品种，功能主治发汗散寒，宣肺平喘，利水消肿等[1]。其中的多糖组分已被证实具有明显的免疫抑制作用[2-4]，针对小鼠碳廓清、迟发型超敏反应、小鼠溶血素和小鼠脾细胞增殖等体内外药理实验均有明显效果。麻黄总多糖也为治疗哮喘药物麻黄多糖片剂的原料药。对于多糖组成的HPLC研究检测方法柱前衍生也已经相当成熟[5-9]。经毛细管电泳，HPLC等方法[10-12]确定甘露糖、鼠李糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖9种单糖共同组成麻黄多糖。

本实验利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）对其中单糖醛基进行定量衍生反应，并对实验过程中的实验条件进行摸索与讨论总结，发现最终实验条件下衍生物无异构体产生，且可通过HPLC法对麻黄粗多糖中4种含量较多的单糖进行测定。故此方法准确率高，精密度良好，适用于多糖中单糖含量的精密测定。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters Alliance HPLC色谱仪，包括2695四元泵、2998紫外检测器，SB-5200D型超声波清洗器（宁波实验仪器厂有限公司）；梅特勒AL204、AB265-S型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo Group公司）；Milli-Q纯水器（密理博上海贸易有限公司）；EYELA OSB-2100旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）。

1.2 试剂

实验原料购于安徽济人药业有限公司，经黑龙江中医药大学药用植物学教研室苏连杰教授鉴定为麻黄科植物草麻黄（Ephedra sinica Stapf）的干燥草质茎；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolon,PMP,北京化学试剂公司）；单糖对照品:甘露糖（Man）,核糖（Rib），鼠李糖（Rha）,葡萄糖醛酸（GlcUA）,半乳糖醛酸（GalUA）,葡萄糖（Glc）,半乳糖（Gal）,木糖（Xyl）,阿拉伯糖（Ara）均为美国Sigma公司产品，纯度均大于99%。

三氟乙酸（AR天津市福晨化学试剂厂）；甲醇、乙腈为色谱纯（美国Dikama公司）；Na2HPO4（AR天津市天力化学试剂有限公司）;NaH2PO4（AR天津市凯通化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 麻黄多糖的提取

参考本课题组前期麻黄总多糖提取条件[10-14]，并优化。取麻黄干燥草质茎100g，精密称定，加80%乙醇溶液7倍量，回流提取3h，过滤，加14倍量水，加热回流提取3次,每次3h，所得药液浓缩至料液比1∶1，加入乙醇至醇体积分数为80%，常温下静置36h，回收沉淀，80℃下烘干，既得麻黄总多糖产物。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供使品溶液

游离供使品溶液 取麻黄总多糖10mg，精密称定，加入3.0mL蒸馏水中，摇匀使其全部溶解，既得。

水解供使品溶液 取麻黄总多糖10mg，精密称定,置于安瓿瓶中，加入2mol·L-1的三氟乙酸溶液2.0mL，在瓶中充满N2封口，110℃下水解3h，将反应后溶液转移至鸡心瓶中，利用旋转蒸发仪，甲醇反复减压浓缩至无酸味。精密加入3.0mL超纯水溶解残渣，既得。

2.2.2 对照品溶液 分别取9种单糖（甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖）的对照品适量，精密称定，置于10mL容量瓶中用水溶解至刻度，摇匀，配置成每1mL含1mmol或2mmol的混合对照品溶液，并且同时分别用相同方法配置各单糖的单独对照品溶液，备用。

2.3 衍生化产物的制备

将单糖对照品、混合对照品、麻黄总糖游离糖样品溶液和麻黄总糖水解样品溶液各取100μL分别置于10mL塑料离心管中，依次加入0.3mol·L-1NaOH溶液100μL和0.5mol·L-1的PMP甲醇溶液200μL，用0.3mol·L-1NaOH调节pH值至7～8之间,混匀。置于70℃水浴中反应30min左右。取出室温下放置10min,加入与上述NaOH溶液等体积的0.3mol·L-1HCl溶液，震荡混匀，再向其中加入12.5%的磷酸盐缓冲液使其定容至1mL。加入5mL氯仿，震荡涡旋30s，5000r·min-1离心5min，取上层溶液，12000r·min-1再次离心5min，取出上清，过0.45μm滤膜，既得[4-8]。

2.4 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱（250×4.6mm，5μm），流速：0.8mL·min-1，流动相：100mmol/L磷酸盐缓冲液（pH值为6.8）（A）-乙腈（B）；等度洗脱：A:84%，B:16%。柱温：30℃，进样量：10μL，检测波长：245μm。

图1 对照品（A）与样品（B）衍生物色谱图Fig.1 Chromatograms of standards（A）and sample precolumn derivation products（B）

2.5 不同批次的麻黄总糖水解液和水溶液测定结果

取不同8批次制备的麻黄粗多糖，分别按“2.2”项下方法进行供使品溶液的制备，在“2.4”项色谱条件下测定，结果见表1。

表1 不同批次麻黄粗多糖中4种单糖含量Tab.1 Contents of saccharine in the total Exphedra saccharide from different batches

3 方法学考察

3.1 线性关系

分别精密吸取上述混合对照品溶液2，4，6，8，10mL置10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为系列对照品混合溶液。在“2.4”项色谱色谱条件下分别进样测定，记录峰面积的响应值，以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线见表2。

表2 4种单糖衍生物的线性关系Tab.2 Linear relationship for precolumn derivation product of four monsaccharide

表2 结果表明，在线性浓度范围内，浓度和峰面积呈良好线性关系。

3.2 精密度实验

精密吸取混合单糖衍生对照品溶液，按“2.3”项下进行衍生，日内连续进样6次，测得日内4种单糖的保留时间和峰面积RSD均小于2%，作为日内精密度。连续3d重复进样4次，测得4种单糖的日间保留时间和峰面积的RSD均小于3%，作为日间精密度。结果表明，仪器精密度良好。

3.3 重复性实验

取同一批麻黄总糖（批号20160401）样品水解液，按照“2.3”项下平行制备6份，分别在“2.4”项色谱条件下进行分析，测得麻黄总糖样品中4种单糖的RSD均小于3%，证明此方法重复性良好。

3.4 稳定性试验

取同一供试样品，按“2.2”项下方法制备供使品溶液，在“2.4”项色谱条件下精密测定，0、2、4、8、16、24h进样后的峰面积。结果峰面积的RSD均小于3%,表明该方法重复性良好。

3.5 加样回收率实验

取含有量已知麻黄总糖（批号20160401）供使品10mg，精密称定，按“2.3”项下方法制备，取水解复溶后溶液50μL 9份，分别置于9个10mL塑料离心管中，向其中分别加入低、中、高不同量的4种单糖混合对照品溶液50μL，按“2.2”项下方法制备，每个浓度平行制备3份，进行HPLC分析，记录各单糖峰面积的响应值，带入标准曲线计算供使品中糖含量，计算回收率，结果见表3，回收率均在98%～102%之间，表明此方法测定准确。

表3 回收率测定结果（n=3）Tab.3 Results of recovery tests（n=3）

4 讨论

4.1 色谱条件

分别考察了100mmol·L-1磷酸缓冲盐-乙腈和50mmol磷酸缓冲盐-乙腈作为流动相时等度洗脱和梯度洗脱，流速0.6、0.8、1mL·min-1等条件下，色谱峰的分离度情况，其中鼠李糖与核糖，木糖和阿拉伯糖的峰难于分离。经综合考察在以100mmol·L-1磷酸缓冲盐为流动相时，9种单糖的分离度最好。流速在0.8mL·min-1时，机器状态最佳，半乳糖，木糖，阿拉伯糖3种单糖恰好分开。且磷酸盐缓冲液要现用现配，不用时要放置在4℃下保存。

4.2 糖水解条件

在糖水解的条件中，水解方法有很多，包括完全酸水解（无机酸、有机酸水解），部分酸水解，碱水解等等，水解时间和封口气体也受到糖醛酸是否发生分解和水解是否完全等因素影响，本实验中参考有关文献[4-8]对上述条件进行考察，最后得出最佳水解条件为110℃下，三氟乙酸水解3h，其中用非氧化性气体N2封口，此条件下麻黄粗多糖水解完全，含量稳定，节省能源。

4.3 PMP衍生样品稳定性

实验过程中，对衍生过程中加入碱的含量、衍生试剂用量、衍生温度、以及是否需要加入12.5%的磷酸盐缓冲液维持pH值进行了对比考察，在0.3mol·L-1NaOH溶液和0.5mol·L-1的PMP甲醇溶液体积比1∶2，衍生温度70℃左右，且衍生时间在30min以上时，衍生完全[5-9]。并发现经缓冲液稀释后的样品稳定性比普通双蒸水稀释的样品稳定性高，且峰面积较稳定无较大变化，基线较平稳，但是双蒸水稀释样品中，糖醛酸的峰面积会逐渐下降，难以维持稳定。12.5%磷酸盐缓冲盐稀释样品在24h内基本稳定。

5 结论

经过对总糖中的糖含量的分析，表明麻黄总糖中含量较多的主要单糖为阿拉伯糖、半乳糖醛酸、葡萄糖,其中阿拉伯糖和葡萄糖更是占到总糖组成中的60%左右。经过对水解后的总糖含量减去游离糖含量，换算得到对应单糖的含量[9]，麻黄粗多糖中葡萄糖醛酸不低于12.7mg·g-1，半乳糖醛酸不低于64.5mg·g-1，阿拉伯糖不低于19.5mg·g-1，葡萄糖不低于53.5mg·g-1。本次实验不仅为麻黄粗多糖中部分单糖的含量测定提供了依据，同时也为麻黄多糖片中单糖含量测定提供了可靠实验方法。