超声波辅助提取白芸豆皂苷的工艺

石瑞，王朝转，宿婧，史晓晶，王明华

忻州师范学院生物系（忻州 034000）

芸豆是一种可以食用的豆科植物，生物学名为菜豆，又称二季豆或四季豆，属豆科菜豆属的小宗杂粮作物。芸豆具有丰富的营养和很高的药用价值，如含有丰富的蛋白质、脂肪、膳食纤维、维生素A、维生素C、钙、钠、铁等[2]。芸豆含有的花色苷、皂苷等成分，能提高人体的非特异性免疫，增强抗病能力，激活T淋巴细胞和抑制肿瘤细胞等作用。芸豆中的皂苷类物质能促进脂肪的代谢，是减肥者理想的食品之一[2]。有研究表明，皂苷类物质还具有多种药理作用，如抗真菌、抗炎、抗氧化、防止心血管疾病、降血糖和免疫调节、降低胆固醇等[1]。

提取皂苷的方法有超声波提取法、微波提取法、超临界流体萃取法和回流提取法等[3]。试验采用超声波提取法，使用超声波辅助提取皂苷既节省了提取溶剂和减少提取时间，同时有利于对有效成分的保护。试验以乙醇体积分数、超声时间、超声功率和料液比为研究因素，探讨白芸豆皂苷的最佳提取工艺，以期为白芸豆皂苷的开发与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

白芸豆（山西省忻州市）。

无水乙醇；高氯酸；香草醛；冰乙酸；齐墩果酸标准品；甲醇；试验试剂均为分析纯，试验用水为一次蒸馏水。

1.2 主要设备与仪器

密封型手提式粉碎机（DXF-0AC，浙江红景天工贸有限公司）；电热鼓风干燥箱（KHD-40A，中新医疗仪器有限公司）；型数控超声波清洗器（KQ4800TV，深圳市光点超声波设备有限公司）；低速离心机（LC-4016，北京卓山电子科技有限公司）；二列八孔智能水浴锅（HK-27，常州金坛良友仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（UV-1800，浙江塞德仪器设备有限公司）；紫外可见光谱仪（岛津UV2550，岛津技迩商贸有限公司）；电子天平（JA203，深圳市科衡仪器电子有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 白芸豆皂苷提取工艺路线

白芸豆粉→称量→超声浸提→离心→取样液→测定吸光度→计算皂苷含量

1.3.2 白芸豆皂苷提取率的计算

取各0.1 mL上清液，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，摇匀，在60 ℃恒温水浴锅显色10 min，取出后置于冰水中冷却至室温，加5 mL冰醋酸摇匀，静置15 min，以提取液空白作为对照，在478 nm处测定其吸光度。对应齐墩果酸标准曲线，计算得到白芸豆皂苷含量[4]。

式中：X为芸豆皂苷总含量，mg/g；V为样品定容的体积，mL；C为提取液质量浓度，mg/mL；M为白芸豆粉末质量，g。

1.3.3 超声时间的选择

准确称取白芸豆粉1 g，固定料液比1∶20（g/mL）、乙醇体积分数70%、功率60 W，分别以超声时间10，20，30，40，50和60 min进行试验，进行超声提取，在转速4 000 r/min离心机中离心10 min，取上清液定容到50 mL。取上清液0.1 mL按照1.3.2方法，以提取液空白为对照，在478 nm处测定吸光度，探讨超声时间对白芸豆皂苷提取率的影响。

1.3.4 料液比的选择

准确称取白芸豆粉1 g，超声功率60 W、乙醇体积分数70%、超声时间30 min，分别以料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL）进行试验，进行超声提取，在转速4 000 r/min离心机中离心10 min，取上清液定容到50 mL。取上清液0.1 mL按照1.3.2方法，以提取液空白为对照，在478 nm处测定吸光度，探讨料液比对白芸豆皂苷提取率的影响。

1.3.5 超声功率的选择

准确称取白芸豆粉1 g，固定料液比1∶20（g/mL）、乙醇体积分数70%、超声时间30 min，分别以超声功率60，75，90，105，120和135 W进行试验，进行超声提取，在转速4 000 r/min的离心机中离心10 min，取上清液定容到50 mL。取上清液0.1 mL按照1.3.2方法，以提取液空白为对照，在478 nm处测定吸光度，探讨超声功率对白芸豆皂苷提取率的影响。

1.3.6 乙醇体积分数的选择

准确称取白芸豆粉1 g，固定料液比1∶20（g/mL）、超声时间30 min、功率60 W，分别以乙醇体积分数40%，50%，60%，70%，80%和90%进行试验，进行超声提取，在转速4 000 r/min离心机中离心10 min，取上清液定容到50 mL。取上清液0.1 mL按照1.3.2方法，以提取液空白为对照，在478 nm处测定吸光度，探讨乙醇体积分数对白芸豆皂苷提取率的影响。

1.3.7 正交试验的设计

根据单因素试验结果采用L9(34)正交设计对白芸豆皂苷提取条件进行优化，设定正交试验因素水平表，见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.3.8 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 17.0对试验数据进行分析，用Origin软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

由图1可知，齐墩果酸标准曲线的回归方程为y=0.000 4x+0.005 6，R2=0.985 1，标准曲线的相关性良好。根据提取液的上清液吸光度，对应齐墩果酸标准曲线，可以计算出提取液中的白芸豆皂苷含量，进一步可计算出白芸豆皂苷提取率。

图1 齐墩果酸标准曲线

2.2 超声时间对白芸豆皂苷提取率的影响

由图2可知，超声时间10～30 min时，白芸豆的皂苷提取率随提取时间的增加而呈现上升趋势，超声时间30 min时，白芸豆的皂苷提取率达到最大值，达5.96%，之后皂苷提取率开始下降。分析原因可能是适当的超声时间会有利于皂苷分子的溶出，而超声时间太长会造成蛋白质构型破坏，使得白芸豆中的大豆蛋白凝集沉淀，从而影响大豆皂苷的溶出，因此，白芸豆皂苷最佳超声时间30 min最好。

图2 不同超声时间对白芸豆皂苷提取率的影响

2.3 料液比影响因子

由图3可知，料液比1∶10～1∶20（g/mL）时，白芸豆皂苷提取率和料液比呈正相关，料液比1∶20（g/mL）时，白芸豆皂苷提取率达到最大值，达6.68%。而溶剂用量再增加时提取率降低，说明过高和过低的料液比并不能使皂苷提取率明显提高，因此，白芸豆料液比应选择1∶20（g/mL）比较适宜。

图3 料液比对白芸豆皂苷提取率的影响

2.4 超声功率影响因子

由图4可知，超声功率75 W时，白芸豆皂苷提取率都达到最大值，达到6.48%，随后皂苷提取率反而开始下降，且皂苷的提取率与超声功率的上升呈负相关。分析原因可能是太低超声功率不利于液体介质间产生足够大的振幅，而超声功率太高又会导致液体介质间产生猛烈的撞击作用，微粒间发生剧烈的相互作用会使液体的温度骤然升高，造成皂苷结构的破坏，因此，白芸豆皂苷的超声功率选择在75 W时最适宜。

图4 超声功率对白芸豆皂苷提取率的影响

2.5 乙醇体积分数影响因子

由图5可知，乙醇体积分数从40%增加到70%过程中，白芸豆的皂苷提取率与乙醇的浓度呈现正相关，且乙醇体积分数为70%时，白芸豆皂苷提取率最大，达5.64%，随着乙醇体积分数继续加大，白芸豆皂苷提取率与乙醇体积分数变化量呈负相关。分析原因可能是皂苷中的苷元亲水性很弱低，乙醇体积分数有利于亲水性物质如蛋白质、糖类等杂质的溶解，从而对皂苷的提取率造成影响，而高乙醇体积分数又会增加蛋白质和糖类等杂质溶出，因此，白芸豆皂苷提取的乙醇体积分数为应选择70%为宜。

2.6 正交试验优化白芸豆皂苷提取条件

进行L9(34)正交优化试验，得出最佳提取工艺，试验结果见表2。

由表2极差分析结果可知，影响白芸豆皂苷得率的各因素主次关系为：A（超声时间）＞C（超声功率）＞D（乙醇体积分数）＞B（料液比）。白芸豆皂苷提取的最佳工艺组合为A2B2C2D2，即超声时间40 min、料液比1∶20（g/mL）、超声功率75 W、乙醇体积分数70%。在该条件下，进行验证试验，每1 g白芸豆粉中皂苷的提取率达6.764%。相比于其他正交试验组的结果要好。因此，此工艺条件对白芸豆皂苷提取具有较好的稳固性和可行性。

图5 乙醇体积分数对芸豆皂苷提取率的影响

表2 正交试验结果分析

3 结论与讨论

以忻州杂粮白芸豆为原料，乙醇为提取剂，超声波提取仪辅助提取白芸豆中的皂苷，进行单因素试验和正交优化试验，探讨不同因素对白芸豆皂苷提取工艺的影响。结果表明，影响白芸豆皂苷得率的各因素主次关系为：A（超声时间）＞C（超声功率）＞D（乙醇体积分数）＞B（料液比）。白芸豆皂苷提取的最佳工艺组合为A2B2C2D2，即超声时间40 min、料液比1∶20（g/mL）、超声功率75 W、乙醇体积分数70%。在最优条件下，每1 g白芸豆粉中皂苷的提取率达6.764%。因此，方法在一定程度上优化白芸豆皂苷的提取工艺，具有方法简单，生产周期短，材料经济等特点，可作为白芸豆皂苷提取的理论参考。