绞股蓝饮料的研制及其抗氧化性

马泽刚，杨新春, ，辛超，钟辉云，吴秀丽，李嘉琴

1. 四川卫生康复职业学院医学检验系（自贡 643000）；2. 自贡市第一人民医院检验科（自贡 643000）；3. 哈尔滨工业大学化工与化学学院（哈尔滨 150001）

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino）系葫芦科（Cucurbitaceae）绞股蓝属（Gynostemma）多年生草质藤本植物[1]。绞股蓝在《中药大辞典》中名七叶胆，别名小苦药、遍地生根、五叶参，日本名甘茶蔓等[2-4]。该属植物基源复杂、品种繁多，我国有14种和3变种[5]，广泛分布于陕西、四川、湖北、福建、云南等地。绞股蓝中含有皂苷、多糖、黄酮类等化合物及铁、锌、铜、锰、硒等20多种微量元素[6]。绞股蓝皂苷具有达玛烷型的三萜骨架，与人参皂苷结构类似，是目前唯一在五加科植物以外被发现含有人参皂苷类成分的植物[7]，故有“南方人参”“第二人参”的美誉[8-10]。迄今为止，从绞股蓝分离和鉴定的化物中，共有8种皂苷为人参皂苷，分别为ginsenoside Rb1、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3、malonyl-Rd、Rf[7]。绞股蓝皂苷是绞股蓝的显著药效成分[11-12]，药用效果与人参皂苷相似[13]，国内外均有研究证明绞股蓝皂苷具有明显的抗肿瘤、降血脂、抗疲劳、保肝等作用[4]。

木糖醇又称戊五糖，是一种带有甜味的且具有营养价值的物质，其形似绵白糖，极易溶于水，甜度相当于蔗糖。精制的木糖醇可以食用，有清凉感，并为人体所吸收[14]。

木糖醇在体内的代谢不会影响胰岛素的分泌水平，故不会对血糖水平造成影响[15-16]，所以可用于糖尿病患者食品的生产。木糖醇的甜度约为山梨糖醇的2倍，甘露醇的3倍，因其甜度高、热量低，可作为高级食糖替代物，有利于减肥人士控制热量摄入[17-19]。

木糖醇的热稳定性较好，在食品加工时不会产生美拉德反应。木糖醇还具有不能被绝大多数微生物利用、不易产生霉变等特点[20]。因此，木糖醇被广泛应用于口香糖、巧克力、饮料、糖果等制品中，其添加到饮料中还可改善饮料的风味和品质。

试验以陕西产绞股蓝为主要原料，采用前期研究方法[21]提取绞股蓝总皂苷，并以木糖醇为甜味剂，通过单因素及正交试验，确定绞股蓝提取液、柠檬酸、木糖醇及食盐的添加量，制备出一款色泽美观、风味独特、适合糖尿病患者人群、具有一定保健功能的绞股蓝饮料，为绞股蓝饮料的开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绞股蓝药材（采自陕西平利县），经四川卫生康复职业学院副主任药师钟辉云鉴定为葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino]；1, 1-二苯基-2-苦基肼（美国Sigma公司）；抑制与产生超氧阴离子测试盒、总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；木糖醇（食品级，浙江华康药业股份有限公司）；无水柠檬酸（食品级，潍坊英轩实业有限公司）；乙醇等试剂（均为国产分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；纯净水（怡宝）。

1.2 仪器与设备

可见分光光度计（7200型，尤尼科仪器有限公司）；超声清洗器（KQ5200B型，昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（AE240，瑞士Metter Toledo公司）；pH计（PHS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司）；手持糖度仪（ATAGO（爱拓）中国分公司）；自动控制立式高压蒸汽灭菌器（LDZX-75KBS，上海申安医疗器械厂）；电感耦合等离子发射光谱仪（美国Thermo Fisher公司）。

1.3 工艺流程

绞股蓝→粉碎→绞股蓝总皂苷提取→过滤→调味（木糖醇、柠檬酸、食盐）→精滤→灭菌→冷却、灌装→成品→检验

1.4 工艺要点

1.4.1 绞股蓝总皂苷的提取

根据前期研究成果，陕西产的绞股蓝在总皂苷及4种重要人参皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd成分和含量上均较为占优势[21-22]，故以陕西产的绞股蓝为原料。绞股蓝总皂苷的最佳提取工艺为：60 ℃条件下，60%乙醇回流提取4次，每次2 h，料液比1∶10（g/mL）[21]。但乙醇作为溶剂提取的绞股蓝在感官上较差，苦涩味浓重，无绞股蓝特殊的香气。在制备过程中乙醇会使成本增加，可能不适应未来工业化生产。同时考虑到饮料在制备过程中的卫生问题，故将提取溶剂乙醇改为水。

即称取陕西产绞股蓝，粉碎并过60目筛（孔径0.25 mm），在60 ℃条件下，按照绞股蓝与水质量比1∶10，回流提取4次，每次2 h。合并滤液后并离心过滤，即得绞股蓝总皂苷提取液。

1.4.2 饮料的调配

将制备好的绞股蓝提取液与柠檬酸、木糖醇和食盐进行调配，通过单因素及正交试验，以感官评分作为标准，确定绞股蓝饮料的最佳配方。

1.4.3 灭菌与灌装

将调配好的饮料装入灭菌器中，在100 ℃条件下灭菌10 min。冷却至60 ℃后无菌灌装。

1.5 单因素试验方法

以感官评分为评定标准，研究绞股蓝提取液、木糖醇、食盐及柠檬酸添加量对绞股蓝饮料感官品质的影响。

1.5.1 柠檬酸添加量的确定

固定绞股蓝提取液添加量、木糖醇、食盐添加量分别为30%，3%和0.1%，研究柠檬酸添加量（0.005%，0.010%，0.020%，0.040%和0.080%）对饮料感官评分的影响。

1.5.2 食盐添加量的确定

固定绞股蓝提取液添加量、木糖醇、柠檬酸添加量分别为30%，3%和0.01%，研究食盐添加量（0.05%，0.08%，0.10%，0.12%和0.15%）对饮料感官评分的影响。

1.5.3 木糖醇添加量的确定

固定绞股蓝提取液添加量、柠檬酸、食盐添加量分别为30%，0.01%和0.1%，研究木糖醇添加量（1%，2%，3%，4%和5%）对饮料感官评分的影响。

1.5.4 绞股蓝提取液添加量的确定

固定木糖醇、柠檬酸、食盐添加量分别为3%，0.01%和0.1%，研究绞股蓝提取液添加量（25%，30%，35%，40%和45%）对饮料感官评分的影响。

1.6 正交试验方法

根据单因素试验结果，选取绞股蓝提取液添加量（A）、木糖醇添加量（B）、食盐添加量（C）、柠檬酸添加量（D）为因素，以感官评分为指标，进行L9(34)正交试验，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平设计 %

1.7 感官评分

绞股蓝饮料的配方评价采用感官综合评分法，参考口服饮料感官评价标准，并结合饮料的实际特性，制定评价标准[23]，具体见表2所示。聘请具有饮料感官评价经验的10名食品工作者，按照饮料的色泽、气味、口感与组织形态进行评分，在得分中去掉最高分和最低分后取平均值即为感官得分。

表2 绞股蓝饮料的感官评分标准

1.8 绞股蓝饮料质量指标检测方法

1.8.1 可溶性固形物的测定

用糖度仪测定。

1.8.2 pH的测定

用pH计测定。

1.8.3 稳定性的测定

准确称取制备好的饮料（m1）置于离心管中，在3 000 r/min转速下离心10 min后，取离心后的上清液，称质量，记为m2，按照式（1）计算离心沉淀率，平行测定3次。离心沉淀率越大，表明溶液稳定性越差[24]。

式中：m1为饮料的初始质量，g；m2为饮料离心后的上清液质量，g；w为离心沉淀率，%。

1.8.4 卫生指标的测定

由自贡市第一人民医院检验科测定。

1.8.5 常见重金属含量测定

由哈尔滨工业大学化工与化学学院测定。

1.9 抗氧化能力的测定

1.9.1 对DPPH自由基清除能力的测定

用无水乙醇配置0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。在试管中分别加入2 mL待测液和2 mL的DPPH自由基溶液，充分振摇后置于暗处，在室温下反应30 min，在波长517 nm处测定吸光度。2 mL待测液加入等体积无水乙醇作为样品对照，2 mL的DPPH自由基溶液加入等体积无水乙醇作为空白。测定时用无水乙醇调零，重复3次，取平均值，参照式（2）计算样品的DPPH自由基清除率。

式中：A0为空白对照组吸光度；Ai为样品组吸光度；Aj为阴性对照组吸光度。

1.9.2 对超氧阴离子清除能力的测定

采用南京建成试剂盒进行测定，按照说明书操作如表3。

混匀，静置10 min，用分光光度计测定各管吸光度，波长550 nm，光径1 cm，双蒸水调零，按式（3）计算，得出抗超氧阴离子能力。

抗超氧阴离子能力（U/L）=（OD对照-OD测定）/（OD对照-OD标准）×标准品质量浓度（0.15 mg/mL）×

1.9.3 对ABTS自由基清除能力的测定

采用南京建成试剂盒进行测定，按照说明书操作，如表4所示。

水浴完成后，分别在测定管中加入试剂四0.1 mL，对照管中加入试剂四0.1 mL和样品0.1 mL。混匀，静置10 min，用分光光度计测定各管吸光度，波长520 nm，光径1 cm，双蒸水调零，按式（4）计算，得出抗ABTS自由基能力。

表3 超氧阴离子清除能力测定的操作说明 mL

表4 ABTS自由基清除能力测定操作说明 mL

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 柠檬酸添加量对绞股蓝饮料的影响

柠檬酸添加量对绞股蓝饮料的影响见图1。

柠檬酸具有一定抗氧化作用[25]，适量的添加有助于增加饮料的酸味，并与糖搭配形成酸甜可口的风味，对饮料的影响显著。由图1可知，柠檬酸添加量在0.005%～0.08%范围内对绞股蓝饮料感官评分的影响表现出先增高后降低趋势。柠檬酸添加量小于0.01%时，饮料的酸味明显缺失，糖酸比例不协调，口感较差；柠檬酸添加量大于0.01%时，饮料的酸味渐渐加重，掩盖饮料甜味，导致口感不适。故确定柠檬酸添加量为0.01%。

图1 柠檬酸添加量对产品感官评分的影响

2.1.2 食盐添加量对饮料的影响

食盐添加量对绞股蓝饮料的影响见图2。

饮料中加适量的食盐更能突出甜味，改善风味，同时也可以补充身体流失的盐分。由图2可知，在食盐添加量0.05%～0.15%范围内对绞股蓝饮料感官评分的影响表现出先缓慢增高后下降趋势。食盐添加量大于0.1%时，饮料偏咸，口感不适。故确定食盐添加量为0.1%。

图2 食盐添加量对产品感官评分的影响

2.1.3 木糖醇添加量对饮料的影响

木糖醇添加量对绞股蓝饮料的影响见图3。

饮料中添加木糖醇不仅有利于提高口感，并且不会影响血糖的变化。由图3可知，在木糖醇添加量1%～5%范围内对绞股蓝饮料感官评分的影响表现出先增高后降低趋势。木糖醇加量小于3%时，饮料的甜味较淡，涩味较重；木糖醇添加量大于3%时，饮料的甜味渐渐加重，导致饮料偏甜，并且掩盖绞股蓝的特殊风味。故确定木糖醇添加量为3%。

2.1.4 绞股蓝提取液添加量对饮料的影响

绞股蓝提取液添加量对绞股蓝饮料的影响见图4。

由图4可知，在绞股蓝提取液添加量25%～45%范围内，对绞股蓝饮料感官评分的影响表现出先增高后降低趋势。绞股蓝提取液添加量小于30%时，饮料的绞股蓝风味缺失；绞股蓝提取液添加量大于30%后，饮料的颜色加重，气味增强，口感增添绞股蓝特有苦味，导致饮料的感官评分呈现下降趋势。故确定绞股蓝提取液添加量为30%。

图3 木糖醇添加量对产品感官评分的影响

图4 绞股蓝提取液添加量对产品感官评分的影响

2.2 正交试验结果

绞股蓝饮料正交试验结果见表5。

表5 正交试验结果

根据正交试验结果直观分析，影响因素的主次顺序为：A＞D＞C＞B，即，绞股蓝提取液添加量＞柠檬酸添加量＞食盐添加量＞木糖醇添加量。通过对复合饮料的色泽、香气、滋味及组织状态进行综合评价，9组内感官评分最高为A1B2C2D2，而通过极差得出的最佳配方为A2B2C1D2，对两者进行对比验证试验，在A2B2C1D2工艺条件下，复合饮料的平均感官评分为89分，比A1B2C2D2结果差，因此确定绞股蓝复合饮料的最佳配方为A1B2C2D2。即绞股蓝提取液添加量30%、柠檬酸添加量0.02%、食盐添加量0.08%、木糖醇添加量3%，此时感官评分最高为93分，制备的饮料不仅具有绞股蓝特有风味，并且酸甜可口，容易被接受。

2.3 绞股蓝饮料质量指标检测结果

2.3.1 主要理化指标结果

绞股蓝饮料主要理化指标测定结果见表6。

结果表明，制备的绞股蓝饮料和灭菌后的饮料在可溶性固形物，pH和稳定性方面均有一定变化，但影响不显著。常见重金属如铅、镉、汞和砷等重金属均未在饮料中检出。

表6 绞股蓝饮料主要理化指标测定结果

2.3.2 卫生指标结果

经检测，绞股蓝饮料（灭菌）的细菌总数≤100 CFU/mL、大肠杆菌≤3 CFU/mL，致病菌未检出，符合GB 7101—2015《食品安全国家标准 饮料》要求。

2.4 绞股蓝饮料的抗氧化活性

绞股蓝饮料的抗氧化活性结果见表7。

抗氧化试验表明，绞股蓝总皂苷提取液有较强的抗氧化能力，制备的绞股蓝饮料对于DPPH自由基、超氧阴离子自由基及ABTS自由基均有一定清除能力，且在灭菌前后的变化不显著，表明绞股蓝饮料中的抗氧化活性成分未明显受高温灭菌的影响，工艺的灭菌条件可行。

表7 绞股蓝饮料抗氧化活性测定结果

3 结论与讨论

采用单因素及正交试验确定绞股蓝饮料的最佳配方：即绞股蓝提取液添加量30%、柠檬酸添加量0.02%、食盐添加量0.08%、木糖醇添加量3%。试验制备的绞股蓝饮料，色泽美观，不仅具有绞股蓝独特的风味，而且还矫正绞股蓝原有的苦涩感，口感酸甜适宜，并且不含任何防腐剂，符合GB 7101—2015《食品安全国家标准 饮料》质量要求。

对于添加的木糖醇，不仅增加饮料甜度，也不会引起血糖变化，特别适合糖尿病患者饮用。灭菌后所制得的饮料成品，在可溶性固形物、pH、稳定性及抗氧化活性方面与灭菌前都有一定变化，这可能是在高温灭菌时对饮料中一些物质造成影响，但差异不显著。抗氧化活性结果发现绞股蓝饮料对DPPH自由基、超氧阴离子自由基及ABTS自由基均有一定清除能力。试验结果为绞股蓝在饮料方面的应用提供理论和实践参考，后续试验将对制备的饮料中具体皂苷类、多糖类物质进行定量分析。