大孔吸附树脂纯化羟基积雪草苷的工艺

雷芳 ，罗祥敏 ，陈伟，刘世会，何珺*

1. 贵州大学药学院（贵阳 550025）；2. 贵州省生化工程中心（贵阳 550025）

积雪草为伞形科积雪草属积雪草（Centella asiatica（L.）Urb.）的干燥全草。性寒，味苦、辛，具有清热利湿、解毒消肿之功效，用于湿热黄疸、中暑腹泻、砂淋血淋、痈肿疮毒、跌扑损伤[1]。现代研究发现积雪草主要含有三萜（Triterpenoids）及其苷类、挥发油（Volatile oil）、黄酮类（Flavonoids）、生物碱（Alkaloids）等化合物。大量文献表明羟基积雪草苷可以促进伤口愈合、刺激肉芽组织生长、促进表皮角质化，并有助于形成新的结缔组织[2]，临床上常用于治疗各种创伤、烧灼伤，痤疮以及整形美容手术等引起的瘢痕。戴卫波等[3]研究表明，羟基积雪草苷具有抗炎、抗氧化及神经保护等药理作用；王雪松等[4]研究表明，羟基积雪草苷具有调节免疫和降低血糖的作用；Li等[5]研究表明，羟基积雪草苷通过调节cmetpkc-erk1/2-COX-2-PGE2级联的活性来抑制肝癌细胞的增殖和侵袭，表明羟基积雪草苷对肝生长因子相关的肝癌有控制作用。

现有研究报道主要是对积雪草中的积雪草总苷进行富集纯化[6-10]，其中鄢玉芬等[6]研究结果表明，采用大孔吸附树脂的方法对积雪草中积雪草总苷进行分离纯化含量由1.64%提高至60.67%；黄建军等[7]的研究结果表明，积雪草总苷含量为61.28%；杜建平等[8]的研究结果表明，通过大孔吸附树脂分离纯化得到的积雪草总苷纯度为55.27%。但没有对积雪草中羟基积雪草苷进行富集纯化的相关报道，因此首次采用大孔吸附树脂对羟基积雪草苷进行富集纯化研究，期望为工业生产高含量积雪草提取物提供参考。

1 仪器与试药

1.1 药材与试剂

干燥积雪草（2019年9月购于贵州贵阳花果园中药材市场）；对照品羟基积雪草苷（批号：17111621，纯度≥96.1%，上海同田生物技术股份有限公司）；DM130、D101、AB-8、LX-60型大孔吸附树脂（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）；HPD417、HPD300型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公）司；甲醇、乙腈（色谱级，德国MWE-CK）；磷酸（天津市永大化学试剂有限公司）；水为娃哈哈水（贵阳娃哈哈昌盛饮料有限公司）和自制蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪，G1312C Bin Pump VL，G7129A Vialsampler，G1316A TCC，G1315D DAD VL（美国安捷伦科技公司）；BSA124S和BT25S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-B95循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；YA·ZD·5型不锈钢电热蒸馏水器（上海南阳仪器有限公司）；其他为一般常规仪器。

2 方法与结果

2.1 羟基积雪草苷含量测定

2.1.1 HPLC测定色谱条件

色谱柱：Neptune C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸水（0 min 25∶75→20 min 25∶75→30 min 30∶70→40 min 40∶60→50 min 50∶50）梯度；柱温25 ℃；检测波长206 nm；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备

取适量羟基积雪草苷对照品，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液进行超声溶解，定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度为0.193 mg/mL的羟基积雪草苷的对照品溶液，即得。

2.1.3 线性关系的考察

精密吸取4，8，12，16和20 μL羟基积雪草苷对照品溶液，注入液相色谱仪，按2.1.1小节的色谱条件进行分析，记录色谱峰面积，分别以进样量（μL）为横坐标（X），以测得峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。羟基积雪草苷标准曲线的回归方程为：Y=163.76X+10.06，R2=0.999 6，表明羟基积雪草苷在0.772～3.860 μg范围内呈良好线性关系。

2.1.4 积雪草提取液的制备

精密称取100 g积雪草粗粉，加20倍量的50%乙醇浸渍提取1次，2 h，滤液回收乙醇至无醇味，冷藏静置过夜，加水稀释，得积雪草提取液。

2.1.5 样品含量测定

分别精密吸取10 μL对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，HPLC色谱图如图1和图2所示，富集纯化后积雪草提取物如图3所示。

图1 对照品色谱图

图2 药材色谱图

图3 纯化产品

2.2 羟基积雪草苷大孔树脂柱分离纯化工艺研究

2.2.1 树脂预处理[8]

将DM130、D-101、HPD417、AB-8、LX-60和HPD300 6种型号树脂，先用95%的乙醇浸泡24 h，用蒸馏水洗至无醇味，用5% NaOH浸泡3～5 h，水洗至中性，再用5% HCl浸泡3～5 h水洗至中性，备用。

2.2.2 静态吸附试验

称取预处理后的树脂，各3 g，分别置于250 mL三角瓶中，各添加80 mL积雪草提取液，置23 ℃恒温摇床，以160 r/min的转速振荡吸附12 h，使羟基积雪草苷充分吸附；滤过，吸干树脂表面水分，加入50%乙醇，各200 mL，置23 ℃恒温摇床，以160 r/min的转速振荡解吸12 h，使羟基积雪草苷充分解吸。检测滤液和洗脱液中羟基积雪草苷的含量，并计算饱和吸附量和解吸率。结果见表1。

表1 不同大孔树脂的静态吸附和解析性能

由表1可知，DM130、D101、AB-8、LX-60和HPD300的吸附率以及解吸率均较好，回收溶剂，从提取物纯度可以看出D101纯度明显高于LX-60、HPD300、AB-8和DM130，并且D101每千克价格明显低于LX-60、HPD300、AB-8和DM130。综合考虑，选择D101型大孔吸附树脂作为生产用羟基积雪草苷纯化树脂。

2.2.3 动态吸附与解吸试验考察

2.2.3.1 泄露曲线的绘制

取30 mL（20.0 g）D101型大孔吸附树脂装柱，量取300 mL 1.80 mg/mL的积雪草药液，以1 BV/h的流速上柱进行吸附，收集流出液，每20 mL为一个流份，共收集16份，以羟基积雪草苷泄露质量浓度为纵坐标（Y），收集流份为横坐标（X）作泄露曲线，结果见图4。

由图4可以看出，第1～第11份时几乎无羟基积雪草苷泄露，第12份出现泄露，故确定20 g D101大孔吸附树脂的羟基积雪草苷安全上样量为19.8 mg/g。

图4 D101大孔吸附树脂泄露曲线图

2.2.3.2 上样流速的确定

取30 mL（20.0 g）D101型大孔吸附树脂，各3份，分别湿法装入相同规格的层析柱中，再取3份220 mL等质量浓度羟基积雪草苷提取液上柱，并控制上样流速分别为1，2和3 BV/h，进行动态吸附，分别收集流出液，测定并计算流出液中羟基积雪草苷含量，结果如图5所示。

由图5可以看出，随着上样流速的增大，流出液中羟基积雪草苷含量也随之升高，说明高流速上样时目标成分损失大，低流速可使目标成分充分吸附于树脂。综合考虑，选择上样流速1 BV/h。

图5 不同上样流速的吸附效果（n=2）

2.2.3.3 洗脱剂乙醇体积分数的考察

将处理好的40.0 g（60 mL）D101大孔吸附树脂湿法装柱，上样440 mL，上样流速为1 BV/h，水洗至流出液无颜色，再依次用10%，30%，50%，70%和90%乙醇各3 BV进行洗脱，分别收集各乙醇洗脱液，用高效液相色谱法测定并计算洗脱液中羟基积雪草苷含量，结果如图6所示。

通过分析图6可知，当乙醇体积分数＜50%时，洗脱液中羟基积雪草苷含量随洗脱剂浓度的升高而升高；当乙醇体积分数＞50%时，洗脱液中羟基积雪草苷含量呈下降趋势，70%以及更高体积分数乙醇洗脱液中羟基积雪草苷含量甚微，即用50%乙醇就能最大限度地将羟基积雪草苷解吸完全，故确定最佳洗脱溶剂为50%乙醇。

图6 不同体积分数乙醇的解吸效果

2.2.3.4 50%乙醇洗脱用量的考察

将200 mL上样液上40 g（60 mL）D101型大孔吸附树脂，上样流速1 BV/h，水洗至无色，用6 BV 50%乙醇洗脱，每60 mL收集一份洗脱液，用高效液相测定并计算洗脱液中羟基积雪草苷含量，结果见图7。

通过分析图7可知，第2 BV时50%乙醇洗脱液中羟基积雪草苷含量已达到最大值，第4 BV时50%乙醇洗脱液中羟基积雪草苷含量甚微，说明已基本解吸完全。因此，确定4 BV为50%乙醇洗脱剂最佳用量。

图7 洗脱剂用量对解吸的影响

2.2.3.5 树脂最佳径高比的考察

取3根等规格的树脂柱，湿法装入处理好的D101，使径高比分别为1∶4，1∶6和1∶8，上等体积等质量浓度上样液，水洗至无色，再用5 BV 50%乙醇洗脱，收集每1 BV 50%乙醇洗脱液，测定并计算提取物中羟基积雪草苷质量浓度，结果如图8所示。

图8 径高比对羟基积雪草苷吸附及解吸影响

通过分析图8可知，当径高比为1∶4时，羟基积雪草苷集中被第1，第2和第3 BV洗脱剂解吸出来，但是树脂床过短导致目标物质泄漏，径高比为1∶6和1∶8均能将羟基积雪草苷吸附解吸。三者比较，径高比为1∶6时分离效果最好，利于得到高含量产品，因此确定1∶6为最佳径高比。

2.2.4 工艺验证试验

精密称取100 g积雪草粗粉，加20倍量的50%乙醇浸渍提取一次，一次2 h，滤液回收乙醇至无醇味，冷藏静置过夜，加水稀释，得积雪草上样液。平均分成3份，每份200 mL，上样液湿法上样加入到树脂径高比为1∶6的层析柱中，上样流速为1 BV/h，水洗至无色，以4 BV 50%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，于60 ℃真空浓缩至干，称其质量，测定羟基积雪草苷含量，结果见表2。

由表2可以看出，3次平行验证RSD值小于2%，所以采用D101大孔吸附树脂分离纯化羟基积雪草苷的工艺重复性好，工艺稳定可行，羟基积雪草苷含量由1.87%提高至27%以上，说明大孔吸附树脂对羟基积雪草苷富集纯化具有显著效果。

表2 羟基积雪草苷纯化工艺验证

3 结论

试验通过大孔吸附树脂的方法对积雪草提取液进行分离纯化研究。经比较DM130、D-101、HPD417、AB-8、LX-60、HPD300六种型号树脂静态吸附率和解析率，结果发现D101大孔树脂为积雪草总苷纯化的最佳树脂。通过动态吸附，对上样体积、上样流速、洗脱液浓度、洗脱液体积、树脂径高比进行了研究，试验确定积雪草总苷纯化最佳工艺为羟基积雪草苷上样量19.8 mg/g，上样流速1 BV/h，乙醇洗脱体积分数50%，乙醇洗脱体积4 BV，树脂径高比1∶6，在该条件下羟基积雪草苷的含量提高至27.4%。

试验通过采用大孔吸附树脂的方法对积雪草中羟基积雪草苷进行分离纯化，结果发现经过大孔树脂纯化后羟基积雪草苷高度富集，杂质减少，该纯化工艺操作简单，周期较短，树脂可重复利用，降低了工艺成本，与其它纯化方法相比，更利于大生产实际应用。