信阳大别山区云芝多糖的纯化工艺及其抗氧化活性
2020-12-01叶润陈颐辉蔡静李尽哲孙伟潘岩
叶润，陈颐辉，蔡静，李尽哲，孙伟，潘岩
信阳农林学院生物与制药工程学院（信阳 464000）
云芝（Coriolus versicolor）又名单色云芝、灰芝、彩纹云芝等，为多孔菌科云芝属植物，硬木质，呈深褐色。云芝具有抗肿瘤、抗肝硬化、抗动脉粥样硬化、抗氧化、延缓衰老等作用[1-2]。
云芝多糖为云芝中的主要药物活性成分之一，对治疗肝炎、慢性肝炎、延缓衰老等有极好疗效。近年来随着中药市场崛起，对云芝多糖的研究逐渐深入，阻碍云芝多糖更深入利用的主要原因是多糖的提取、纯化的成本高，收率低，纯度不够[3-4]。已报道的云芝多糖提取的方法有水提醇沉法、超临界萃取法、纤维素酶解法等[5]，多糖的提取率在10%左右，但是所得多糖纯度偏低。目前报道的云芝多糖纯化方法有盐析法、沉淀法、渗析法等，这些方法的成本太高，且纯度提升并不明显[6-8]。
试验用大孔树脂法对云芝多糖进行纯化，通过对大孔树脂的静态-动态吸附进行考察，筛选出最佳纯化树脂及纯化条件。试验方法稳定可行，且大孔树脂再生简单，值得大规模推广。
1 材料与方法
1.1 主要材料
云芝（采于信阳市大别山区鸡公山，经信阳农林学院梁丽香副教授鉴定）；大孔树脂（山东鲁抗立科药物化学有限公司）；葡萄糖对照品（中国生物药品检验所）；1, 1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、ABTS二铵盐、抗坏血酸（VC）（上海晶抗生物工程有限公司）；无水乙醇、双氧水、苯酚、水杨酸（上海中石化三井化工有限公司）。
1.2 主要设备
FA2204B电子分析天平（上海精科天美公司）；30 mm×300 mm层析柱（江阴市新辉层析设备有限公司）；RE-201智能升降水浴锅（南京科尔仪器设备有限公司）；RE-85Z旋转蒸发仪（巩义市英峪予华仪器）；UV-2600紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 云芝多糖的粗提
将云芝干燥并粉碎至粒径0.425 mm，置于烧杯中，用5倍量的水在60 ℃水浴中浸泡12 h，过滤，将滤液浓缩后加入95%乙醇，静置1 h，待沉淀完毕后过滤，重复3次，干燥，得粗多糖样品，纯度为46.81%，备用[9]。
1.3.1.1 大孔树脂的处理
取10种不同型号的大孔树脂，先用蒸馏水洗涤，接着用4倍柱体积的95%乙醇浸泡24 h后，用蒸馏水洗涤至无乙醇味，将处理好的大孔树脂分别用4倍柱体积5% NaOH和HCl溶液浸泡3 h，用蒸馏水洗涤至中性[10]。
1.3.1.2 静态吸附考察
将1.3.1中的样品配置成质量浓度5.0 mg/mL溶液，取10种不同型号的大孔树脂各1 g，放入250 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL样品溶液，将锥形瓶置于30 ℃恒温摇床上振荡24 h，取上清液，UV法测定多糖浓度，按式（1）和（2）计算大孔树脂的吸附量及吸附率。
将吸附后的大孔树脂过滤，蒸馏水洗涤后，加入100 mL体积分数85%的乙醇溶液，在同样条件下进行解吸，取解吸液用UV法测定多糖的浓度，按式（3）计算解吸率。
式中：c0为样品溶液中多糖的原始质量浓度，mg/mL；c1为大孔树脂吸附后溶液中多糖质量浓度，mg/mL；c2为解吸液中多糖质量浓度，mg/mL；V为样品溶液体积，mL；m为干燥的大孔树脂质量，g。
1.3.2 静态吸附的动力学曲线
将1.3.1中的样品配置成质量浓度5.0 mg/mL溶液，取AB-8型大孔树脂1 g，放入250 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL样品溶液，将锥形瓶置于30 ℃恒温摇床上振荡吸附6 h，每隔0.5 h取1 mL溶液，测定吸光度，计算吸附率，绘制吸附曲线[11]。
1.3.3 动态吸附-吸附效果的影响因素考察
确定最佳纯化树脂为AB-8型大孔树脂，将1.3.1中的样品配制成质量浓度5.0 mg/mL溶液，取20 mL，用稀盐酸分别调节pH 1.0，2.0，3.0，4.0和5.0，以2.0 BV/h（1 BV=50 mL）的速度上样并静置2 h，保持柱温在30 ℃，收集流出液，测定吸光度，计算大孔树脂的吸附率。再固定其他因素，分别考察上样质量浓度3.0，4.0，5.0，6.0和7.0 mg/mL，上样速率1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 BV/h对大孔树脂吸附效果的影响。
1.3.4 动态吸附-解吸效果的影响因素考察
将1.3.1中的样品配制成质量浓度5.0 mg/mL溶液，取20 mL，按照1.3.3确定的最佳条件上样，分别用3.0 BV 0（蒸馏水），10%，30%，50%，70%和90%的乙醇溶液洗脱，洗脱速率2.0 BV/h，收集洗脱液，测定吸光度，计算大孔树脂的解吸率。固定其他因素，分别考察洗脱剂用量1.0，2.0，3.0和4.0 BV，洗脱流速1.0，2.0，3.0和4.0 BV/h对大孔树脂解吸效果的影响。
1.3.5 验证试验
按照确定的最优条件，选AB-8型号大孔树脂，将1.3.1中的粗糖配制成质量浓度5.0 mg/mL溶液，取20 mL，调节pH 4.0，以2.0 BV/h速度上样并静置2 h，保持柱温在30 ℃，用70%乙醇溶液洗脱，洗脱剂用量分别在3.0 BV，洗脱速度在1.0 BV/h，收集洗脱液，测定吸光度，计算多糖含量。
1.3.6 含量测定
选葡萄糖为对照品，用苯酚-硫酸法测量多糖含量[12]。按式（4）计算多糖含量。
式中：W为多糖含量，%；c为洗脱液中多糖质量浓度，mg/mL；V’为洗脱液体积，mL；m为洗脱液干燥后样品总质量，g。
1.3.7 抗氧化活性测定
1.3.7.1 DPPH自由基清除能力
用无水乙醇在100 mL容量瓶中配制浓度为0.5 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，放冰箱中保存待用。将纯化后的多糖溶液用乙醇分别稀释到0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6 mg/mL，取1.0 mL的DPPH-乙醇溶液，分别向其中加入1.0 mL不同质量浓度的多糖溶液，室温下静置30 min，在517 nm波长处测定吸光度（A样品）。用乙醇代替DPPH作为对照组测定吸光度（A对照）。用蒸馏水代替多糖溶液作空白组，测定吸光度（A空白）。用相同浓度的维生素C溶液按照上述方法进行测定，作为阳性对照[13]。
1.3.7.2 ABTS自由基清除能力
制备ABTS自由基工作液：将等体积浓度7.5 mmol/L的ABTS二铵盐溶液和2.5 mmol/L的K2S2O8混合过硫酸钾溶液混合，避光保存，反应15 h，即生成ABTS阳离子自由基，使用前，用无水乙醇将自由基储备液进行稀释，使其在734 nm波长下的吸光度为0.7±0.1。取2 mL该溶液，向其中分别加入0.5 mL质量浓度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6 mg/mL的多糖溶液，避光条件下反应10 min，在734 nm波长测定吸光度（A样品）。用蒸馏水代替ABTS自由基工作液作为对照组测定吸光度（A对照）。用蒸馏水代替多糖溶液作空白组，测定吸光度（A空白）。用相同浓度VC溶液按照上述方法进行测定，作为阳性对照[14]。
1.3.7.3 羟自由基清除能力
采用Fenton体系法，分别取2.0 mL质量浓度1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0和8.0 mg/mL多糖溶液，向其中加入1.0 mL浓度5.0 mmol/L水杨酸溶液和1.0 mL浓度5.0 mmol/L硫酸亚铁溶液，摇匀后，加入1 mL浓度为5.0 mmol的H2O2和2 mL蒸馏水，置于30 ℃水浴锅中反应0.5 h，在510 nm处测定吸光度（A样品）。用蒸馏水代H2O2测定吸光度为（A对照）。用蒸馏水代替多糖溶液测定吸光度为（A空白）。用相同浓度的VC溶液按照上述方法进行测定，作为阳性对照[15]。
2 结果与分析
2.1 大孔树脂的筛选
10种大孔树脂的吸附效果见表1，其中AB-8、DM18、D140型号大孔树脂对云芝多糖的吸附率最高，但是DM18、D140型号大孔树脂的解析率偏低，这应该与这2种大孔树脂的比表面积大有关系。从大孔树脂的吸附率及解析率2方面综合考虑，最终确定AB-8型号大孔树脂，为最佳纯化树脂。
表1 10种大孔树脂的静态吸附效果
2.2 静态吸附的动力学曲线
结果如图1所示，吸附时间2.0 h前，AB-8型大孔树脂对云芝多糖的吸附呈递增趋势，吸附时间2.0 h后，吸附量趋于稳定，吸附基本达到饱和。
图1 静态吸附的动力学曲线
2.3 动态吸附-吸附效果的影响因素考察
结果如图2所示，在pH 4.0之前，吸附率随着pH增大而增大，之后降低。在pH 4.0时，AB-8型号大孔树脂对云芝多糖的吸附率达到最大值，这应该与大孔树脂内吸附的离子有关系。
上样质量浓度大于5.0 mg/mL，AB-8型大孔树脂对云芝多糖的吸附率开始明显降低，表明此时大孔树脂已经达到吸附饱和，再加大上样浓度，云芝多糖将不能被吸附。
上样速率小于2.0 BV/h，处于柱子下面大孔树脂无法接触到多糖溶液；上样速率大于2.0 BV/h，柱子中的大孔树脂与多糖溶液接触的时间不够，都会导致吸附率降低。
因此，最佳上样条件为：pH 4.0，上样浓度5.0 mg/mL，上样速率2.0 BV/h。
图2 各因素对吸附效果的影响
2.4 动态吸附-解吸效果的影响因素考察
结果如图3所示，乙醇体积分数50%时，AB-8型大孔树脂对云芝多糖的解吸率最高，这与多糖的极性有直接的关系。
随着洗脱剂用量加大，多糖逐渐被解吸，解吸率逐渐增大，洗脱剂用量3.0 BV时，解吸率达到最大值，即使继续用洗脱剂洗脱，多糖也不能被洗脱。
洗脱速率2.0 BV/h时，云芝多糖的解吸率最高。这是因为洗脱速率太小会导致多糖在树脂柱中停留时间太长，不利于洗脱；洗脱速率太大会导致洗脱剂来不及与多糖充分接触。
因此，最佳解吸条件为：乙醇体积分数50%、洗脱剂用量3.0 BV、洗脱速率2.0 BV/h。
2.5 验证结果
采用确定的最佳条件，选用AB-8型号大孔树脂进行上样、洗脱等纯化操作，云芝多糖的纯度从46.81%提高到81.24%。
2.6 体外抗氧化性
结果如图4，DPPH自由基清除率与云芝多糖浓度纯在数量关系，随着质量浓度增大而增大，云芝多糖质量浓度0.8 mg/mL时，对DPPH自由基的清除能力达到96.17%，之后达到平缓，IC50=0.388 mg/mL，表现出很强清除能力。
随着云芝多糖质量浓度增加，对ABTS自由基清除能力也逐渐增加，云芝多糖质量浓度0.6 mg/mL时，最大清除能力达到85.35%，IC50=0.419 mg/mL，同浓度下清除能力略小于VC，表现出很强清除能力。
随着云芝多糖质量浓度增加，对羟自由基的清除能力也逐渐增加，云芝多糖质量浓度7.0 mg/mL时，达到最大清除率为80.32%，IC50=4.423 mg/mL，同浓度下清除能力虽小于VC，但仍表现出很强的清除能力。
图3 各因素对解吸效果的影响
图4 抗氧化性结果
3 结论
以信阳市大别山区云芝为原材料，通过水提醇沉法对多糖进行提取，借助大孔树脂进行纯化，确定AB-8型号大孔树脂为云芝多糖的最佳纯化树脂，最佳上样条件为：pH 4.0，上样质量浓度5.0 mg/mL，上样速率2.0 BV/h。最佳洗脱条件为：乙醇体积分数50%，洗脱剂用量3.0 BV，洗脱速率2.0 BV/h。通过AB-8大孔树脂的纯化，云芝多糖纯度由46.81%提高到81.24%。对DPPH、ABTS、羟自由基都有较好的清除作用，且随着多糖质量浓度增大而增强。工艺稳定可行，且大孔树脂的再生能力强，可为信阳市大别山区云芝资源的开发利用提供科学依据。
