代谢综合征患者肠道菌群特征探析▲

王 萍 王 颖 万 红 段 飞 燕树勋

(1 河南中医药大学第一附属医院内分泌科二病区，郑州市 450000；2 郑州大学第一附属医院老年心血管科，河南省郑州市 450000，电子邮箱：wangping2016a@163.com)

代谢综合征(metabolic syndrome，MS)是全球公认的健康“隐形杀手”[1]。MS包括糖脂代谢紊乱、高血压、高尿酸血症等，其发病机制尚未明确。既往认为，胰岛素抵抗是MS发病的核心机制，而肥胖、炎症反应、环境因子、遗传因子是胰岛素抵抗的影响因素[2]。但也有学者认为，尽管血糖升高与胰岛素抵抗密切相关，但肥胖或能量失衡与MS危险因素的关联性更紧密[3]。临床发现，在相同的遗传背景和能量摄入条件下，人体高血糖和体重增加等的表现差异较大[4-5]。多项研究表明，肠道菌群与代谢性疾病关系密切，MS进程中的糖脂代谢紊乱、氧化应激炎性反应等均可引起肠道菌群改变，肠道菌群的紊乱又可加速MS的进展[6-7]。肠道菌群能够影响宿主的糖、脂肪、蛋白质等多种营养物质的代谢，并维持肠黏膜功能正常[8]，是宿主的一个“能量代谢器官”[9-10]。目前对MS的治疗侧重于单一的减重、降糖、调脂、降压等，缺乏特异性多靶点治疗药物，而通过不同方式调节肠道菌群，改善代谢紊乱，是一种潜在的治疗方法。然而，目前关于肠道菌群与MS关系的研究仍以动物实验为主，本研究观察MS患者的肠道菌群特点，分析肠道微生物与MS的内在联系，以期为临床治疗MS提供新的治疗靶点和个性化的防治策略。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年3～5月于河南中医药大学第一附属医院内分泌科住院治疗的26例MS患者为观察组，其中男性14例，女性12例，年龄36～63(41.60±6.85)岁。另选取32例在社会招募及在河南中医药大学第一附属医院参与健康体检的健康志愿者为对照组，其中男性18例，女性14例，年龄35～60(42.67±6.36)岁。MS组纳入标准：(1)符合中华医学会糖尿病学分会制定的MS诊断标准[11]；(2)汉族，年龄35～65岁。对照组纳入标准：(1)身体状况良好的非MS人群；(2)汉族，年龄35～65岁，无不良生活习惯(如抽烟、喝酒、长期饮用碳酸饮料)；(3)常规体检项目均在正常值范围。两组排除标准：(1)近1周内有感染、发热、创伤、烧伤的患者或活动性肺结核病或风湿免疫疾病者；(2)有较严重的肠道疾病或代谢性疾病史，近4周内有腹泻、便秘等胃肠道反应；(3)合并甲状腺功能异常等其他内分泌疾病、冠心病、心脏瓣膜病(1个及以上瓣膜发生中度病变)或原发性心肌病、严重肺部疾病及脑血管疾病、肾功能不全(血清肌酐男性>221 μmol/L，女性>177 μmol/L)、肝功能不全[谷丙转氨酶>正常值(40 U/L)的3倍]或合并肝硬化、造血系统或恶性肿瘤等严重原发性疾病、脏器移植、既往有手术史者；(4)近3个月内使用过可能影响肠道菌群变化的药物，如抗生素、非甾体类药物、微生态制剂、胃肠动力药物等；(5)严重精神障碍患者(如感知障碍、思维障碍等)；(6)孕妇、哺乳期妇女；(7)正参加其他临床试验的志愿者；(8)标本留取过程中有污染者、未及时冻存者、标本留取量不足者。两组研究对象之间无血缘关系，年龄、性别差异均无统计学意义(均P>0.05)。所有研究对象均自愿参与本研究并签署知情同意书。

1.2 样本采集和检测方法 样本采集前，采用调查问卷详细记录受试者的年龄、性别、饮食习惯及饮食结构(三餐饮食习惯、饮食量及食物结构配比)等特征。粪便样本采集前排净小便。用无菌一次性采样杯采集新鲜粪便样本后保存于常温保存液中(含样品保护液)，7 d内完成DNA提取。

由博奥颐和健康科学技术(北京)有限公司采用PCR技术扩增和Illumina MiSeq高通量测序平台分析两组研究对象肠道菌群的结构和属水平上的相对丰度。粪便样本采用16S rRNA细菌检测技术鉴定肠道菌群。16S rRNA细菌检测方法为：采用粪便提取试剂盒(天根生化科技有限公司，批号：DP711-T1)对粪便样本进行基因组DNA抽提，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA纯度和浓度。随后采用KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit(美国KAPA Biosystems，批号：KK2602)扩增细菌16S rRNA的V3～V4区，上下游引物序列分别为5′-X-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；PCR反应体系包含0.25 μL高保真聚合酶，5 μL 5×反应缓冲液，5 μL 5×高GC缓冲液，0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，10 μL模板DNA，1 μL正向引物(10 μmol/L)，1 μL反向引物(10 μmol/L)，11.25 μL超纯水；PCR扩增程序为98℃预变性5 min，98℃变性0.5 min、50℃退火0.5 min、0.5 min延伸72 ℃共25个循环，72℃扩展延伸5 min。将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司，批号：AP-GX-50)切胶回收PCR产物，采用Tris-Hcl洗脱回收产物；将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，按照对DNA量的测序要求将各样本按比例混合后构建Illumina平台文库并测序。

1.3 质量控制 前期培训所有调查人员，使其掌握相关检测标准。随机重复检测10%的粪便样本。粪便肠道菌群由博奥颐和健康科学技术(北京)有限公司统一检测。由不同人员采用Excel软件采取双人双录入模式录入数据。

1.4 生物信息学分析 采用Trimmomatic软件(v0.27)[博奥顾和健康科学技术(北京)有限公司]以滑动窗口法对双端的核酸序列进行质量过滤。利用Vsearch软件(v2.8.1)依照97%相似性划分分类操作单元，聚类时剔除嵌合体；基于分类操作单元的聚类分析结果和分类学信息对各个分类水平进行群落结构的统计分析。通过Mothur 1.31.2软件获得Alpha多样性指数中的Ace指数和Shannon指数；Ace指数反映标本中菌群丰度，即分类操作单元数量；Shannon指数反映菌群的多样性，包括菌群丰度和菌群均匀度。采用Qiime软件(v2.1)计算标本间un-weighted unifrac距离矩阵以分析菌群的β多样性，并绘制主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)图形。

1.5 统计学分析 应用Excel 2013及SPSS 23.0软件进行数据的录入与分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，比较采用两独立样本t检验或t′检验；非正态分布的计量资料以M(P25，P75)表示，比较采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组样品主坐标分析结果 PCoA结果可显示菌群在不同环境下的相似性和差异性。图1中每个点都代表1个检测样本的菌群，点与点间距离大小代表菌群之间的相似性，距离越小越相似；观察组和对照组在PCoA图上均能各自聚类，说明两类人群的肠道菌群β多样性具有差异。见图1。

图1 两组样品PCoA图

2.2 两组样品多样性分析 观察组Ace指数为82.76±7.47，Shannon指数为4.22±0.82；对照组Ace指数为157.54±10.76，Shannon指数为7.73±1.92；观察组Ace指数、Shannon指数均低于对照组(t=30.022，P<0.001；t′=9.346，P<0.001)。

2.3 两组样品微生物属水平上的相对丰度 观察组的芽孢杆菌属、梭菌属、普雷沃氏菌属、巨单胞菌属、肠球菌属的丰度高于对照组，瘤胃球菌属、毛螺菌属的丰度低于对照组(均P<0.05)。见表1。

表1 两组样品微生物属水平上的相对丰度[M(P25，P75)]

3 讨 论

厚壁菌门中的大多数细菌可产生丁酸盐，研究表明，肥胖小鼠肠道丁酸盐含量明显高于非肥胖小鼠，且产生丁酸盐的细菌含量增加可加强宿主的摄食能力，导致肥胖的发生[12-13]，而腹型肥胖为MS发生的核心机制之一[3]。芽孢杆菌在健康成人胃肠道中存在的比例较少，而相对于普通人群，肥胖人群肠道中芽孢杆菌含量明显升高[14]。波士顿医学中心的研究人员证实梭菌感染是肥胖发生的可能风险因子[15]。Zhang等[16]的研究证实肥胖者肠道中的普雷沃氏菌含量丰富。普雷沃氏菌可参与碳水化合物和蛋白质的发酵，促进机体更有效地从食物中摄取营养成分[17]。巨单胞菌可发酵各种碳水化合物产生乙酸、丙酸和乳酸，乙酸能进入肝脏代谢，参与肌肉、脾脏、心脏和脑内代谢[18]。肠球菌为人和动物肠道内的正常菌群，但在一定条件下也是条件致病菌。韩竖霞等[19]的研究表明肠球菌属是老年糖尿病患者尿路感染的病原菌。肠道中肠球菌属含量与三酰甘油水平呈正相关，肠球菌属占肠道总细菌的比例与高密度脂蛋白水平呈负相关[20]。有学者发现，饲养宠物的青少年肠道内可能拥有较多的瘤胃球菌，这可能与其过敏和肥胖症发生率低相关[21]。高脂饮食能够增加回肠和结肠内炎症因子的表达，而肠道中毛螺菌/链球菌比例失调亦可引起代谢紊乱，与肠道炎症密切相关[22]。本研究结果显示，两组样品菌群组成差异较大，观察组的菌群多样性指数、瘤胃球菌属及毛螺菌属丰度低于对照组，芽孢杆菌属、梭菌属、普雷沃氏菌属、巨单胞菌属、肠球菌属丰度高于对照组(P<0.05)，提示MS患者与健康人群肠道菌群的多样性及上述菌群丰度存在差异。

有研究表明，MS肥胖男性患者在接受来自体重正常人群的粪菌移植后，其三酰甘油水平迅速下降，证实了肠道菌群和脂代谢关系密切，且粪菌移植对能量代谢相关疾病可能有一定的疗效[23]。在限制脂肪和碳水化合物饮食后，肥胖患者体质量明显下降，胰岛素抵抗得到改善，肠道菌群结构发生改变[24]。而益生菌及益生元可通过改善肠道菌群紊乱来降低炎症因子水平、提高胰岛素敏感性，改善MS病情[25]，如加氏乳杆菌能降低肝脏三酰甘油水平及脂肪基因的表达，从而在一定程度上防止体重的增加[26]。此外，Zhong等[27]发现丹皮、赤芍可调节高脂饮食导致的肠道菌群失调，其作用类似于二甲双胍。以上研究均提示，由糖脂代谢紊乱、炎症反应等引起的MS与肠道菌群的紊乱关系密切。

综上所述，MS患者与健康人群肠道菌群的多样性及特定菌群丰度存在差异，差异菌群集中在厚壁菌门(包括芽孢杆菌属、梭菌属)、普雷沃氏菌属、巨单胞菌属、肠球菌属、瘤胃球菌属、毛螺菌属等，MS患者肠道菌群失调可能与MS的发生和发展有关。